文档介绍：关于蛋白质定位
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本节课的主要内容
蛋白质的定位
细胞器的分离
免疫印迹法
具体的实验实例
第二页，本课件共有44页
蛋白质定位
无论原核还是真核细胞都有一个高度有序的结构，新生的蛋白质都要被准确的运送到细胞的各个部分，如溶酶体、线粒体、叶绿体、细胞质和细胞核等，以更新其结构组成和维持其功能，这一过程称为蛋白质的定位。
真核细胞具有复杂的亚细胞结构。每种细胞器都有一组特定的蛋白。
真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大部分蛋白是在胞浆或糙面内质网合成，最终运至不同地点，形成成熟的蛋白质并行使功能。
细胞根据蛋白质是否携带分选信号以及分选信号的特征，选择性地将各种蛋白质送到细胞不同部位。根据蛋白分子定位信号，可引导蛋白质在胞内定位。
细胞内蛋白质的分选和运输对于维持细胞的正常结构与功能、完成各种生命活动非常重要，在许多情况下，蛋白质的异常转位与细胞的病例变化密切相关。
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蛋白质定位
蛋白质的亚细胞定位常用方法：
差速离心、密度梯度离心法；免疫胶体金标记；免疫荧光；免疫印迹法；与GFP构建融合基因表达融合蛋白；
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细胞器的分离技术
离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据
物质颖粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，
而使物质分离的分离分析技术。
细胞分级分离式一种通过离心从而分离细胞内不同结
构成分的细胞器。不同的细胞器的大小和密度不同，在
同一离心场内的沉降速度不同，用差速离心法、密度梯
度离心法、密度梯度平衡离心法分离细胞器
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差速离心：
采取逐渐提高离心速度的方法分离大小不同的细胞器。 被分离的分子越小，需要的离心速度越高。
大颗粒首先沉到管底
较小颗粒沉降
细胞器沉降顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、核蛋白体。
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密度梯度离心法：
预先装入有一定密度梯度的材料（蔗糖或甘油），利用各种颗粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的颗粒处于同一梯度层内。
注：待分离颗粒密度比介质密度都要大：
不能离心太久，否则两种颗粒都会沉到底部
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差速离心法
其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。
缺点是：
①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；
②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；
③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。
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密度梯度离心法
该法的优点是：
①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；
②适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；
③颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
缺点：① 离心时间较长；②需要制备梯度；③操作严格，不宜掌握。
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部分细胞器的分离方法
一般采用差速离心或密度梯度离心的方法得到分离细胞器。
•细胞膜又称质膜，分离细胞膜有助于研究生物膜的结构与功能。一般说，红细胞膜与线粒体膜的制备用差速离心法即可，其他细胞膜的分离可根据膜组分的密度大小不同，采用梯度离心后，分布于指定区域，可分离得到纯制品
•线粒体普遍存在于真核细胞中，它是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需能量主要依靠在线粒体内进行氧化所产生的能，线粒体的分离主要靠差速分离。
•线粒体膜分离方法主要是密度梯度离心
•核糖体是由核糖酸和蛋白质组成的核糖核酸蛋白颗粒，附着在粗面内质网的称固着核糖体，分散在细胞内的称游离核糖体，数个或数十个核蛋白体聚在一起称为聚核糖体，一般用差速离心法可分离出聚核糖体。
•微粒体是一种脂蛋白所包围的囊泡，含核糖核酸，蛋白质和脂类，分离微粒体的方法是利用分级离心法，去掉细胞核和线粒体后，经超速离心而制备。
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