文档介绍：分子生物学讨论
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甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP) (GenBank 登录号: )的异常表达与肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤有关，请根据基因表达的检测方法，设计实验方案从转录水平检测AFP的表达情况。实验方案包括：实验目的、实验方法及原理、技术路线、可能的结果分析及应用等。
题目
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甲胎蛋白
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甲胎蛋白是一种糖蛋白，正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，胎儿出生后约两周甲胎蛋白从血液中消失，在胎儿13周AFP占血浆蛋白总量的1/3。在妊娠30周达最高峰，以后逐渐下降，出生时血浆中浓度为高峰期的1%左右，约40mg/L，在周岁时接近***水平（低于30μg/L）因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克/升。
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胎儿：甲胎蛋白在产妇羊水或母体血浆中AFP可用于胎儿产前监测。如在神经管缺损、脊柱裂、无脑儿等时，AFP可由开放的神经管进入羊水而导致其在羊水中含量显著升高。血浆AFP在妊娠16-18周可见升高而有诊断价值，但必须与临床经验结合，以免出现假阳性的错误。
***：AFP可以在大约80%的肝癌患者血清中升高，在生殖细胞肿瘤出现AFP阳性率为50%。在其它肠胃管肿瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出现不同程度的升高。当肝细胞发生癌变时，却又恢复了产生这种蛋白质的功能，而且随着病情恶化它在血清中的含量会急剧增加，甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标。
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荧光定量RT-PCR检测
AFP mRNA基因表达
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实验简介
实验
目的
实验方法
实验结果
逆转录PCR（reverse transcription PCR）是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
建立荧光定量RT-PCR方法检测AFP mRNA基因表达的方法，了解肝癌组织中AFP mRNA的表达水平
用荧光定量PCR方法检测33例肝癌及癌旁组织AFP mRNA表达水平。。
33例肝癌组织和癌旁组织AFP mRNA表达均阳性，肝癌组织AFP ±，癌旁组织AFP ±
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病例选择及取材 收集住院确诊的原发性肝癌病人33例，年龄45～65岁，平均56岁。术中切取少量新鲜的肝癌组织及癌旁1cm的肝组织，迅速至-80℃冻存
组织总RNA的提取 ，采用Trizol（Invitrogen公司）提取组织的总RNA，操作按说明进行。提取后的RNA测A260-A280吸光值，要求A260/～，并计算出RNA含量。
材料与方法
引物、探针的设计合成 从Genebank中调出AFP的DNA和RNA序列，根据引物设计原则，上游引物位于外显子1和2之间，序列为5-TGGAATAGCTTCCATATTGGGATTC－3‘，下游引物位于外显子3上，序列为5’－CCAGTTTGTTCAAGAAGCCACTT－3’。
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4 cDNA的合成 取2μg组织标本总RNA，加入15pmol的AFP mRNA的下游引物和DEPC水，70℃预变性5min，立即放于冰上，然后加入5×RT Buffer 5μl，10mmol dNTPs 5μl，RNasin 25u，M-MLV 200u，37℃ 反应1h，95℃ 5min灭活逆转录酶。合成好的cDNA置于－20℃备用。
5 荧光定量RT-PCR检测临床组织标本的AFP mRNA 荧光定量PCR检测临床组织标本的AFP mRNA的反应体系： 5×PCR buffer 10μl、上下游引物各15pmol、10mmol dNTPs 1μl、、Taq DNA聚合酶3u、AFPmRNA的cDNA或阳性定量模板5μl，加无菌去离子水至50μl。反应条件为：93℃ 2min，93℃ 30s，60℃ 1min，共40个循环。反应在PE7700（美国PE公司）扩增仪上进行。反应结束后用计算机将样本与标准曲线对比得出AFP mRNA基因表达的拷贝数。
6 统计学处理 本实验数据计量资料采用几何均数±标准差（x±s），两组样本间均数比较采用独立样本t检验（并做方差齐性检验）