文档介绍：上海交通大学
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上海交通大学医学院 2008 届硕士生毕业论文
胚胎干细胞向心肌细胞分化中内皮细胞的作用
摘要
研究背景和目的:在缺血性心脏疾病中,细胞移植治疗具有广阔的前
景,而具有多项分化潜能的胚胎干细胞作为一种具有治疗作用的组织,拥
有巨大的临床应用潜力。最近,很多研究都指出胚胎干细胞来源的内皮细
胞对于缺血性心脏疾病可能有治疗作用。众所周知,心肌细胞生活在血管
系统微环境中,心肌细胞和内皮细胞在发育过程中,几乎同时从生心中胚
层中产生,但迄今为止,没有直接证据证明两者在胚胎干细胞分化过程中
有着功能性的联系。本研究通过添加外源性内皮细胞和抑制内源性内皮细
胞的方法,观察胚胎干细胞向心肌细胞分化这一过程的变化,从而为胚胎
干细胞分化过程中这两种细胞之间的关系提供直接的证据,为今后内皮细
胞应用于临床心脏疾病提供细胞学方面的依据。
方法:采用常规悬滴培养分化的方法,借助 CGR8-GFP 这一荧光蛋白
检测小鼠胚胎干细胞系心肌特异性的肌球蛋白重链(α-MHC)的表达情
况观察胚胎干细胞向心肌细胞分化过程。第一个实验是添加入不同数量的
外源性内皮细胞和成纤维细胞,观察胚胎干细胞分化所得心肌细胞数量的
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上海交通大学医学院 2008 届硕士生毕业论文
变化。第二个实验是添加内皮细胞特异性抑制剂-Endostatin,观察当内
源性内皮细胞被抑制后,胚胎干细胞分化为心肌细胞数量的变化。第三个
实验是在添加内皮细胞特异性抑制剂 Endostatin 的基础上,再次加入不
同数量的外源性内皮细胞,观察胚胎干细胞分化所得心肌细胞数量的变
化。
结果:1、在胚胎干细胞的分化过程中,相比加入外源性成纤维细胞
(NIH3T3,小鼠胚胎成纤维细胞-MEFs),加入外源性内皮细胞(人类骨
髓微血管内皮细胞-BMECs, 人类脐静脉内皮细胞- HUVECs)后,心肌细
胞形成明显增多(P=)。BMECs的作用相对比较稳定,但存在细胞
数量依赖效应:200个BMECs,是早期获得大量心肌细胞的最少外源性内皮
细胞数(P=)。2、当使用特异性内皮细胞抑制剂-Endostatin时,
在内源性内皮细胞被抑制的同时,心肌细胞的形成也明显减少。
Endostatin存在剂量依赖效应,2ug/ml能够明显抑制内皮细胞和心肌细胞
(P=)。第0天加入endostatin,第10天或者第15天收集分化的拟胚
体,无论是心肌细胞还是内皮细胞的标记物,在基因水平和蛋白质水平表
达都明显下调(P=)。3、外源性内皮细胞与胚胎干细胞的共培养能
够挽救由于内源性内皮细胞抑制(由Endostatin所介导)而导致的心肌细
胞形成障碍。在分化的第9天,在添加200个外源性内皮细胞(BMECs)的
组中,无论是否添加endostatin,都出现了跳动的心肌细胞团,在每组72
个拟胚体中,加入endostatin组出现了9个(%),没有endostatin的
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组中出现了38个(%);而在没有添加外源性内皮细胞的组中,无论
是否添加endostatin,都没有出现一个跳动的心肌细胞团(P=)。
结论:在胚胎干细胞分化过程中,内源性的内皮细胞对于促进心肌细胞的
形成起着至关重要的作用,是形成心肌细胞发育微环境的关键因子。而在
胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中,外源性的内皮细胞可以刺激心肌细胞
的形成,从而得到