文档介绍：. .
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普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的根本原理和操作步骤
普通PCR
1概述
聚合酶链式反响(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DN***段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶〔DNA polymerase I〕最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 那么是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反响。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 那么是于1976年从温泉中的细菌〔Thermus aquaticus〕别离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用那么于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制〔类似PCR前两个周期反响〕的实验。而现今所开展出来的PCR那么于1983由 Dr. Kary B. Mullis开展出的，Dr. Mullis当年效劳于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
2 PCR原理
PCR技术的根本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个根本反响步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP〔脱氧核糖核苷三磷酸〕为反响原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保存复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保存复制链〞，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
3. PCR反响体系与反响条件
10×扩增缓冲液 10μl
4种dNTP混合物 200μl
引物 10～100μl
模板DNA ～2μg
Taq DNA聚合酶 μl
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Mg2+
加双或三蒸水 100 μl
PCR反响五要素
参加PCR反响的物质主要有五种即引物(PCR引物为DN***段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液〔其中需要Mg2+)。
［PCR步骤］标准的PCR过程分为三步：
〔90℃-96℃〕：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 〔25℃-65℃〕：系统温度降