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各种DNA提取方法
一,基因组DNA提取方法
制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的 片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使 DNA断裂和 降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。主要是CTAB 方法,其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方 式:异硫***酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有: 硅质材料、阴离子交换树脂等
试验步骤:
1、 贴壁细胞用胰酶消化,离心收集。
2、 细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次,离心收集。试验步骤2再重新作一 边。
3、 加入 5mlDNA 提取缓冲液,(10mmol/LTris-%SDS) 混匀。
4、 加入25ul蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml混匀,50 C水浴3h
5、 用等体积的酚抽提一次,2500rpm离心收集水相,用等体积的(酚,*** 仿,异戊醇)混合物抽提一次,2500r/min离心收集水相
6、 用等体积的***仿,异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL混匀, 冰浴,10min.。
7、 。加入等体积的异丙醇。室温 10min。
2500rpm 离心10min。弃上清。
8、 ()与2倍体积-20 C预冷无水乙醇。 -20 C 20min。
9、 12000r/min室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。
二,外周血DNA提取技术
分离外周血白细胞 提取方法:
试验步骤:
1、 取人肘静脉血5ml,EDTA抗凝,2500rpm 离心10min。
2、 小心吸取上层血浆,。
3、 在血细胞中加入3倍体积的溶血液,摇匀,冰浴15min。
4、 2500rpm 离心 10min,弃上清。
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5、 加入10ml溶血液,摇匀,冰浴15min。
6、 3000rpm 离心 10min,弃上清。
7、 倒置离心管,去掉残液。
8、 得白细胞,—80C冻存。
试验要求:
血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h,4C放置不超过5h, 以防白细胞自溶。
三,***仿法抽提外周血白细胞基因组DNA :
试验试剂:
Ligsisbuffer :
;最后加灭菌去离子水至1000ml,高压灭菌。
ACD抗凝剂: ;最后加灭菌去 离子水至350ml,高压灭菌。
提取缓冲液(Extractionbuffer ): 10mMTrisCI(PH=)(PH=)(PH=)
EDTA(PH=)%SDS10% ;最后加灭菌去离子水至 100ml,
咼压火菌
试验步骤:
1、 在500山抗凝血中加入ligsisbuffer1000 d,充分颠混至清亮。以4000rpm, 离心5min。弃上清液。
2、 沉淀中加入ligsisbuffer1500 d,充分匀浆。以6000rpm,离心5min。
3、 彻底弃去上清,加入extractionbuffer500 d (裂解细胞),混匀置于37 C,水溶1h。
4、 加入8 d的蛋白酶K,颠混,37 C过夜(或55 C, 3h,但是37 C效果 要好些)。
5、 每管加入450 d饱和酚(取溶液下层)缓慢摇晃10min,以5500rpm, 离心15min。
6、 取上清,每管加入250 d饱和酚和250 d***仿—异戊醇,摇匀10min, 以 5500rpm,离心 15min。
7、 取上清,每管加入500 d***仿—异戊醇,摇匀10min,以5500rpm,离 心 15min。
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