文档介绍:免疫荧光技术
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主要内容
技术原理
1
实验流程
2
注意事项
3
常见问题
4
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免疫荧光技术(immunofluorescence)
技术原理
将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出,荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色),可以看见荧光所在的细胞或组织,利用定量技术测定含量,从而可对抗原进行细胞定性和定位分析。
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根据实验方法分类:
直接法
间接法
补体法
其他
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补体法:
利用补体反应,通过形成 抗原-抗体-补体复合物发射荧光。
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其他免疫荧光技术:
时间分辨免疫荧光分析
荧光偏振免疫分析技术
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时间分辨免疫荧光测定
时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)是一种非同位素免疫分析技术,它用镧系元素标记抗原或抗体,根据镧系元素螯合物的发光特点,用时间分辨技术测量荧光,同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨,可有效地排除非特异荧光的干扰,极大地提高了分析灵敏度。
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荧光偏振免疫分析技术
荧光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)是一种定量免疫分析技术,其基本原理是荧光物质经单一平面的蓝偏振光(485nm)照射后,吸收光能跃入激发态,随后回复至基态,并发出单一平面的偏振荧光(525nm)。
偏振荧光的强弱程度与荧光分子的大小呈正相关,与其受激发时转动的速度呈反相关。FPIA最适宜检测小至中等分子物质,常用于药物、激素的测定。
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激光共聚焦扫描显微镜
(Confocal laser scanning microscope,CLSM)
用激光作扫描光源,逐点、逐行、逐面快速扫描成像,扫描的激光与荧光收集共用一个物镜,物镜的焦点即扫描激光的聚焦点,也是瞬时成像的物点。系统经一次调焦,扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时,就可以获得样品不同深度层次的图像,这些图像信息都储于计算机内,通过计算机分析和模拟,就能显示细胞样品的立体结构。
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态,也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。
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