文档介绍：关于原核生物的基因表达与操作课件
第一页，本课件共有57页
第二页，本课件共有57页
目的基因 载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
转化
受体细胞
筛选阳性克隆
大量扩增，获得子代DNA
基因克隆的技术路线
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大肠杆菌表达体系
第四页，本课件共有57页
大肠杆菌表达体系优越性：
1. 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控
的分子机理有深刻的了解；
2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适
用的寄主菌株和不同类型的载体；
3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中
实现有效、高水平的表达；
4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易
用于批量生产。
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大肠杆菌中表达体系的不足：
1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很
大的差别。
2. 真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的
RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因
可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷
酸序列。
3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，
影响真核基因mRNA稳定性。
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4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过
转译后的加工修饰（正确折叠和组装），
而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中
并不存在；
5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基
因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。
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大肠杆菌表达载体
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启动子
核糖体结合位点
转录终止子
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有功能的启动子的分离
一般程序：
1. 选用一种适当的核酸内切酶，消化切割大肠杆菌的染色体DNA
2. 接着将切割产生的DNA限制片断群体，同一种无启动子的质粒载体重组，按实验设计要求使插入的片断恰好紧邻报告基因的上游位置
3. 随后把此重组混合物转化给大肠杆菌寄主细胞，构成质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。
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