文档介绍：免 疫 酶 技 术
基 本 原 理
免疫标记技术（immunolabelling technique）:是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。
特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位
分类：免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫酶技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。
免疫酶技术：是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。
实验一： ELISA方法检测人血清中IgG
酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosor- bent assay, ELISA）
是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。
常用的酶：辣根过氧化物酶
底物为邻苯二***。
常用的方法：间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。
目的：
* 掌握ELISA技术
* 检测血清中IgG含量
材料：
抗人IgG抗体（羊抗人IgG抗体）（一抗）
已知IgG含量的参考蛋白（作标准系列）
待检人血清
辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体（二抗）
包被液：
洗涤液： PBS
底物溶液：OPD-H2O2
终止液：2mol/L H2S04
酶标反应板（一排/人）
操 作 步 骤
包被（用一抗包被）（已做）
洗涤3次(将洗液加入每孔，3min后倾去)
加样：将已知含量的参考蛋白IgG倍比稀释7孔，第8孔加待检血清，第9孔加阴性血清第10孔作空白对照（100ul/孔）。
100ul 稀释液
待测血清
PBS-T20
100ul 标准品
100ul
100ul
孵育（37℃ 40min）
洗涤3次
加酶标记的抗人IgG抗体（即二抗）(100ul/孔)
孵育（37 ℃ 40min）
洗涤3次
显色（加底物溶液，100ul/孔 。室温避光15-30min）
终止反应
检测(490nm波长下检测)
结果观察与分析：
空白对照应无色；
阳性孔呈棕黄色，
标准系列各孔呈明显的颜色深浅梯度；
绘制标准曲线。
注意事项：
做倍比稀释时，应从高浓度到低浓度；
显色时一定避光；
检测时应避免孔中有气泡。
实验二
APAAP法检测淋巴细胞亚群
原理：用抗人T细胞CD的McAb与T细胞的反应，用羊抗鼠IgG搭桥，其中一个Fab段连接抗T的McAb， 另一个Fab段连接APAAP复合物，再通过复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色来判断CD分子的存在，从而确定T细胞的各亚群。
优点：
* 不经化学交联反应，避免了抗体和酶活性降低。
* 省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。
* 标本易于检测，保持时间长。
应用：* 淋巴细胞分化抗原；
* 活化抗原；
* MHC-Ⅰ、Ⅱ类抗原表达的检测。
APAAP法检测淋巴细胞亚群示意图