文档介绍：PCR扩增实验操作步骤
PCR扩增实验操作步骤
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PCR扩增实验操作步骤
一、实验原理
PCR：是一种选择性扩增 DNA或RNA的方法，其基来源理是依照体内细胞分裂中的 DNA
半保存复制机理，以及在体外 dNTP分子于不一样温度下双链和单链能够相互转变的性质，人
为地控制体外合成系统的温度，以促进双链 DNA变为单链 DNA；单链DNA与人工合成的引物
退火，以及在 dNTP存在下，耐高温的 DNA聚合酶使引物沿单链模板延长成为双链 DNA。
PCR反响分3步：①变性：经过加热使 DNA双螺旋的氢键断裂， 双链解离形成单链 DNA；
②退火：当温度忽然降低时，因为模板分子构造较引物要复杂得多，并且反响系统中引物
DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板
DNA双链之间
互补的时机较少。③延长：在
2+
的
DNA聚合酶和4种dNTP底物及Mg存在的条件下，5'→3'
聚合酶催化以引物为开端点的
DNA链延长反响，以上3步为一个循环，每一循环的产物能够
作为下一个循环的模板， 数小时以后，介于两个引物之间的特异性 DN***段获得了大批复制，
数目可达 2×106~7拷贝。
变性
退火
延长
图 反响历程
二、实验资料
PCR扩增实验操作步骤
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PCR扩增实验操作步骤
1·模板：细菌
DNA 2
·
TsgDNA聚合酶
3·dNTP混淆液
PCR扩增实验操作步骤
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4·10倍浓度PCR缓冲液
5 ·LMgCl26
·RAPD引物：S14S15S18S66S74S88S97
PCR扩增实验操作步骤
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S103S110S115 7 ·提取细菌 DNA的有关试剂
三、操作步骤
1．细菌染色体 DNA的提取（见上一组）
2．RAPD反响系统的配置
试剂
浓度
加入量
顺
加
序
10倍浓度PCR缓冲液
样
PCR扩增实验操作步骤
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PCR扩增实验操作步骤
***化镁溶液 L
dNTP混淆液 各L
上游引物 L
下游引物 L
细菌DNA
25~50ng
TsgDNA聚合酶
超纯水
10ul
整体积
25ul
3·反响程序：
将RAPD反响试剂加入 EP管中
轻混后用100ul白腊油覆盖于反响混淆液之上， 防备样品在频频加热 -冷却的过程中蒸
发，盖好盖子
翻开PCR反响仪输入以下反响数据
94摄氏度预变性 5min
94摄氏度变性 40s
40摄氏度退火 40s
72摄氏度延长 1min
将EP管放入仪器开始扩增，循环 35