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为使基因扩增检验技术有效地应用于临床,更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务,保
证检验质量,特制定本规X。
一、临床基因扩增检验实验室的规X化设置与其管理
临床基因扩增检验实验室的规X化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行方法》
(卫医发[2002]10号文附件《临床基因扩增检验实验室根本设置标准》。为防止污染,必须
严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。
临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区
域都必须有明确的标记,以防止设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成
不同的工作区域间设备物品发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序,即只
能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反响混合物配制和扩增区(简称扩增区至产物分
析区,防止发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服,
以便于鉴别。此外,当工作者离开工作区时,不得将各区特定的工作服带出。
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清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因,因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区
至扩增产物分析区的方向进展。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。
(一试剂贮存和准备区
下述操作在该区进展:贮存试剂的制备、试剂的分装和主反响混合液的制备。
贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区,不能经过产物分析
区。在打开含有反响混合液的离心管或试管前,应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存
在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后,应将其分装
贮存备用,防止由于经常打开反响管吸液而造成污染。
含反响混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应
冰冻贮存。为防止因单次反响取液而频繁的冻融主贮存试剂,应分装冰冻贮存试
剂溶液。贮
存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反响数来决定。
主反响混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查,评价结果
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必须有书面报告。对于"热启动"技术(在第一个高温变性步骤后参加酶,聚合酶也可不包
含在主反响混合液中。
在整个本区的实验操作过程中,操作者必须戴手套,并经常更换。此外,操作中使用一
次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。
严禁用嘴吸取液体,加样器和吸头等必须经高压处理。
工作完毕后必须立即对工作区进展清洁。本工作区的实验台外表应可耐受诸如次***酸钠
的化学物质的消毒清洁作用。实验台外表的紫外照射应方便有效。由于紫外照射的距离和能
量对去污染的效果非常关键,因此可使用可移动紫外灯(254nm波长,在工作完成后调至实
验台上60-90cm内照射。由于扩增产物仅几百bp,对紫外线损伤不敏感,因此紫外照射扩增
片段必须延长照射时间,最好是照射过夜。实验室与其设备的使用必须有日常记录。
(二标本制备区
下述操作在该区进展:临床标本的保存,核酸(RNA、DNA提取、贮存与其参加至扩增反
应管和测定RNA时cDNA的合成。
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要正确使用加样器。由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染,所以应防止在本
区内不必要的走动。可通过在本区内设立正压条件防止从邻近区进入本区的气溶胶污染。为
防止样本间的交叉污染,参加待测核酸后,必须盖好含反响混合液的反响管。对具有潜在传
染危险性的材料,必须有明确的样本处理和灭活程序。
用过的加样器吸头必须放入专门的消毒(例如含次***酸钠溶液容器内。实验室桌椅外表
每次工作后都要清洁,实验材料(原始血标本、血清标本、提取中的标本与试剂的混合液等
如出现外溅,如此必须分别处理并作出记录。
对实验台适当的紫外照射(254nm波长,与工作台面近距离适合于灭活去污染。可移动
紫外线管灯可用来确保工作后对实验台面的充分照射。
样本处理对核酸扩增有很大影响,必须使用有效的核酸提取方法,可在开展临床标本检
测前对提取方法进展评价。
用于RNA扩增检测的样本制备好以后,应立即进展cDNA合成,因为cDNA
链较RNA稳定,保
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存相对容易。为保证逆转录反响的需要,应在标本制备区设置一个以上的温育装置。
cDNA合成的理想温度依所使用的酶而定,倾向于使用一步法:即使用在扩增反响缓冲液
条件下具有逆转录活性的热稳定的DNA聚合酶进展逆转录,其较cDNA合成后再开盖以调节缓
冲液或参