文档介绍：临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显示，%的检验误差发生在检验前期，而来pha-casein）、白蛋白等，有防止此类抑制物产生的效果。
棉拭子
在使用PCR方法检测性病病原体时,临床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置5～10分钟,待大块状物下沉后,取上清立即离心,其后的沉淀即可用于DNA提取。
如不立即用于核酸提取,则需保存于-70℃下.
脓液
脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取DNA；水样的脓液则直接离心,沉淀用生理盐水洗2～3次后,即可用于DNA提取。
对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于粘稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置,取上清立即离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按上述直接离心取沉淀即可。
沉淀标本的保存条件同样为-70℃。
体液
临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊液,尿液等,可按水样标本的方式离心取沉淀后,提取核酸。沉淀样本的保存同上。
乳汁
乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、结核分枝杆菌和布鲁氏菌等的PCR检测。
乳汁中分枝杆菌DNA的提取
试剂准备 ①裂解液：50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 异硫氰酸胍盐（GITC）, mol/L 醋酸钠。 ②玻璃珠：（直径：425-600um）
乳汁标本离心6000rpm，5min，弃上清
脂质和沉淀用750ul裂解液重悬
重悬液移入含100mg玻璃珠离心管搅拌
煮沸5min，离心14000rpm，3min
650ul上清转移到另一离心管中，等体积异丙醇沉淀
70%乙醇洗涤沉淀，干燥
50ul Tris-EDTA溶解沉淀即可用于PCR扩增
组织
组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块的处理步聚首先用生理盐水洗两次,然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水后剧烈震荡混匀,离心，弃上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。
新鲜组织最好是保存于50%乙醇中,具体作法是，先用生理盐水将组织洗一次,切成宽度小于1cm的小片,加入适量的生理盐水,然后,边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%.这样固定的组织标本室温下可保存数日,4℃可保存6年。
石蜡切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脱蜡,再用蛋白酶K消化后即可进行DNA提取。
临床标本的滤纸上保存
临床标本置于经过处理的滤纸片上，如靶核酸为DNA，可室温保存数月至数年，如靶核酸为RNA，则可稳定数周。
保存在滤纸上的标本，保存时间长，还可因为标本中的PCR抑制物如血红蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于滤纸上，而不对后面的扩增检测造成影响。
不管是全血、血清（浆）。还是尿液、粪便、分泌物等均可此种方法。
临床标本中PCR反应抑制物
内源性的 :免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。
外源性的 :如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。
肝素的作用机理
肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，标本中的肝素可结合于DNA和RNA上，尽管肝素和核酸本身都带正电荷。
对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用。
肝素的作用机理
,即可100%的抑制酶活性。
在标本中加入肝素酶I 或Ⅱ1~3 U/μg核酸(于5 mM Tris , 1 mM CaCl2, 40 U RNase 25 ℃2小时) 可去除肝素的抑制作用。
血红蛋白、乳铁蛋白
血红蛋白和乳铁蛋白分别是红细胞和白细胞内的主要PCR抑制物,它们均含有铁。抑制机制可能是：
（1）与这些蛋白释放铁离子至PCR混合物中有关。研究铁的抑制效应时，发现其干扰DNA合成，而且胆红素、胆盐和氯化高铁血红素（Hemin）等血红蛋白衍生物，也是PCR抑制物。
（2）1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性
IgG
IgG的抑制作用是由于其与单链DNA的相互作用，使得靶DNA不能与DNA聚合酶相互作用
使用煮沸作为标本处理方法或使用PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反应的抑制
去除或减轻抑制的一些方法
NaOH处理可中和临床标本中的