文档介绍：实验八纤维素酶酶活力的测定实验【实验目的】 1、了解测定纤维酶活力及还原糖的原理。 2、掌握测定纤维酶活力及还原糖的方法。 3、获得部分纤维素酶。【实验原理】纤维素酶是水解纤维素生成纤维二糖及葡萄糖的一类酶的总称。它包括 C 1、 C X酶及纤维二糖酶( β—葡萄糖苷酶)。作用方式: C 1酶C X酶纤维二糖酶天然纤维素----- →直链纤维素---- →纤维二糖--------- →葡萄糖其中 C 1 酶是使天然纤维素晶体都分链,起一个分离作用和水合作用,从而使天然纤维素裂解成为直链纤维素。 C X 酶不能水解天然纤维素,而能水解直链纤维素的β-1,4- 葡萄糖酶键,生成纤维二糖,纤维二糖再经过纤维二糖酶水解成为葡萄糖。本法以滤纸和羧***纤维素钠盐作为底物加入一定量的酶液,在一定的条件下起作用,然后观察滤纸的溃崩情况来判断 C 1酶活力的大小,同时,测定 CM C 水解液中还原糖的含量用来表示 C X酶活力的大小。用羧***纤维素钠盐(CMC) 作底物,经纤维素酶水解后生成还原糖,然后用 DNS 法测定还原糖的含量,从还原糖的数量来求得酶活力的大小。纤维素分子是由β- 葡萄糖从 1,4 键相连的长链,由于纤维素的分子间氢键数目极其多,因此不溶于水,在纤维素分子中β- 葡萄糖上第 2, 3及 5 个碳原子都有一个游离的羧基,如羧基上的氢被羧***取代,由于羧基有着很强的亲水性,因此, CMC 就能溶于水而成为胶状溶液。羧***纤维素无论在结构上或是在性质上都很大程度地不同于纤维素。因为它溶于水。所以,非常容易被纤维素酶水解,在相同的条件下,同一纤维素酶水解 CMC 所产生的还原糖远大于水解纤维素所产生的还原糖,因此 CMC 酶活力只能代表 CX 酶的活力,而且它的数值总是比较高的,所以 CMC 的酶活力只能供参考。测定还原糖的方法很多,只是采用 DNS (3,5-二硝基水杨酸)法,比较简便, 3,5- 二硝基水杨酸是一种氧化剂,能与还原糖作用,使硝基还原成氨基, 溶液变为橙色,在一定还原糖浓度范围内,橙色的深度与还原糖的浓度成正比。因此,可采用比色法求得还原糖的含量。葡萄糖与 DNS 的显色反应如下: COOH CHO ││╱╲ O 2N NO 23,5- 二硝基水杨酸 COOH COOH ││╱╲ O 2N NH 23-氨基,5- 硝基水杨酸由于不同来源的纤维素酶对各种不同的天然纤维素的分解能力是不同的, 即是同一种酶,由于不同的天然纤维素的分解能力各不相同,因此,分解滤纸纤维素较强的酶,对于分解天然纤维素的能力有可能强,为此,在菌种筛选过程中,最好测定在生产上所采用的纤维素原料的分解能力。【仪器、材料和试剂】 1、菌种:纤维素酶产生菌,青霉菌 2、培养基: (1)斜面培养基:麸皮 5% ,琼脂 2% ,28℃, 5-6 天( 2)种子培养基:药媒 3% (北京中棉紫光生物科技公司,药媒 2206 ,蛋白 54% ) 麸皮 3% 、磷酸二氢钾 % 、微晶纤维素 2% 、胰蛋白胨 % 硫酸铵 % 、硫酸镁 % 、***化钙 % 、种子 28℃, 160-180r/min ,培养 1-2 天, 10% 接种量接入发酵瓶(3)发酵培养基:% ,% ,% ,% , 胰蛋白