文档介绍：第五章 核酸的分离与检测
一、核酸的分离、提取通则
核酸在细胞中通常与各种蛋白质结合在一起。
分离原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排除其他分子污染。
分离与纯化的方法一般包括细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分相当于:
50μg/ml双链DNA
40μg/ml单链DNA（或RNA）
20μg/ml寡核苷酸
分光光度计
Biophotometer
Nanophotometer
Single and multi wavelength measurement combined with kinetic methods. The full wavelength scan (190 nm - 1100 nm) allows curve interpretation for attainment of more detailed scientific knowledge over whole spectrum. sample size as low as .
Thermo Scientific NanoDrop 2000c (March 2, 2009)
Thermo Scientific NanoDrop 2000 and 2000c Spectrophotometers. These easy-to-use, UV-Vis instruments enable a 5-second measurement time of DNA, RNA and proteins on a sample size as low as .
核酸纯度鉴定
A260/A280
DNA纯品: A260/A280 =
RNA纯品: A260/A280 =
电泳
核酸的凝胶电泳
当前核酸研究中最常用的方法，常用于检测核酸的分子量、纯度、结构变化、序列分析等
种类：
琼脂糖凝胶电泳（水平电泳）
聚丙烯酰***凝胶电泳（垂直电泳， 分辨率可达1bp常用于测序）
核酸样品的保存
DNA：
，4 ℃或-20 ℃保存；
长期保存样品中可加入1滴***仿。
RNA：
mol/L NaAc ()或双蒸灭菌水中，-70 ℃保存;
长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;
在RNA溶液中， mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。
三、核酸的检测
PCR：常规PCR、RT-PCR、荧光定量PCR
杂交：膜杂交（Southern Blot、Northen Blot）、组织样品原位杂交
（real time PCR）
1996，美国Applied biosystems公司推出：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。
克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。
目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。
灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确。
与常规PCR的区别
常规PCR：PCR结束后对终点产物进行定量分析。
实时定量PCR：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。
两个重要概念
荧光域值（ threshold）：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上 ，一般荧光域值的设置是基线荧光信号的标准偏差的 10 倍。
Ct值（Cycles threshold ） ：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.
Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比 。
荧光定量PCR化学原理
非特异性荧光标记：SYBR Green
特异性荧光标记：TaqMan
① SYBR Green I荧光染料的作用原理
SYBR Green I ：结合于双链 DNA小沟。 PCR 反应体系中，SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号。
优点：与所有双链 DNA 结合，不必因为模板不同而特别定制——通用性；价格相对较低；一个 PCR 产物可以与多分子的染料结合，灵敏度很高。
缺点：能与非特异性双链DNA（如引物二聚体）结合。需要熔解曲线分析。
SYBR Green 熔解曲线分析
② TaqMan探针法
TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，设计为与目标序列上游和下游引