文档介绍：质粒DNA的小量制备
基础植物生物技术
提纲
目的
1
原理
2
材料
3
方法
4
注意事项
5
一、目的
掌握一种较常用的提取质粒DNA的方法
三、材料
质粒DNA的小量制备
基础植物生物技术
提纲
目的
1
原理
2
材料
3
方法
4
注意事项
5
一、目的
掌握一种较常用的提取质粒DNA的方法
三、材料
(一) 仪器
超净工作台；隔水式电热恒温培养箱；摇床；2102型分光光度计；Eppendorf 5417C 常温高速离心机；XW-80型旋涡混合器；电热恒温水浴锅；低温冰箱(-20℃)～-70℃)；稳压电泳仪(0～500V，0～300mA)；Chemi-Smart 2000/3000型化学发光及凝胶成像系统；
(二) 器皿
刻度摇菌管，微量移液器，标记笔, EP管
(三)菌种
大肠杆菌DH-5α中的Hm质粒
(四)培养基
LB液体培养基：
蛋白胨10克﹑酵母提取物5克和氯化钠10克用蒸馏水溶解至1000毫升，用10 mM NaOH调至pH -, 湿热灭菌20分钟。
三、材料
(五)试剂
1．溶液I[50mM葡萄糖10mM EDTA 25mM Tris-HCI(pH )] 配制方法 ：
; M EDTA 1毫升; 1M Tris-HCI (pH ) ,加无菌水至50毫升
2．溶液Ⅱ[ M NaOH；1％ SDS]配制方法：
1M NaOH 2毫升﹑10％ SDS 1毫升加无菌水至10毫升
3．溶液Ⅲ[KAC (pH ) 缓冲溶液]配制方法：
5M KAC 60毫升﹑冰醋酸
三、材料
(五)试剂
／毫升RNaseA：
称取10毫克RNaseA放于灭菌的EP管中，加1毫升TE沸水浴15分钟，室温冷却后-20℃保存。
％SDS溶液:
用70℃无菌水初步溶解10克SDS，后65℃水浴1小时助溶。
：10 mM Tris-HCl (pH )、1 mM EDTA。
三、材料
(五)试剂
-异戊醇(24:1)：
取240毫升氯仿，加入10毫升异戊醇,充 分混匀
：
无水乙醇保存在-20℃冰箱中备用。
：
40 mM Tris-HCI(pH )、20 mM NaAC、2 mM EDTA。
三、材料
(五)试剂
：％溴酚蓝、40％蔗糖
配制方法：、40克蔗糖用100毫升无菌水充分溶解，4℃保存。
12. % 琼脂糖制备
配制方法：，加入6微升10 毫克/毫升EB 于45℃倒入插有点样梳的制胶槽。
三、材料
四、方法
1．取平板活化后的菌落接种于含50毫克／升
Kan的LB液体培养基，37℃振荡培养过夜。
平板活化
震荡培养
接种于LB培养基
加50毫克/升Kan
四、方法
2．，，于室温下12000rpm 离心30秒；
15毫升摇菌管
高速离心机
四、方法
3．取沉淀，重悬于100微升溶液I，于XW-80型旋涡混合器
上完全分散，室温放置5分钟；
4．加人新配的溶液Ⅱ200微升，盖紧管口, 立即反复倒置
5次，室温放置5分钟；
5．加入溶液Ⅲ150微升，倒置混匀，于冰上放置10分钟；
加溶液I
加溶液Ⅱ
加溶液Ⅲ
6．12000 rpm离心10分钟，取上清，计算体积；
7．加入等体积的酚和氯仿-异戊醇(24:1)，混合后于12000
rpm离心10分钟，取上清，，计算体积；
8．加人2倍体积预冷无水乙醇沉淀核酸，室温放置10分钟；
四、方法
加氯仿-异戊醇
加无水乙醇
9．12000 rpm离心 10分钟、小心除去上清，将离心管
倒置于纸巾上；
10．加70％乙醇1毫升，盖紧管口清洗沉淀，12000 rpm
离心10分钟;
11．取沉淀，打开管口室温下充分干