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琼脂稀释法操作步骤.ppt

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文档介绍:原理:
将抗菌药物配制到琼脂培养基中成:128ug/ml 、64ug/ml 、32uug/ml对倍稀释的浓度系列
多点接种器将制备好的细菌菌悬液迅速点种到琼脂表面,经35℃16-20小时培养
肉眼观察细菌生长,以未见细菌生长平板的最低药物多数细菌来说,上述用生长法或直接菌落悬浮法制备的麦氏浊度的菌悬液,应该再用无菌肉汤或生理盐水行1:10稀释,此时菌液浓度为1-2*107CFU/ml,调整好的菌液应该在制备后的15分钟内完成点种

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菌液准备4
如一次实验需完成50株或100株细菌,则细菌要编上工作序号1-50或1-100,并在结果记录纸上要一一对应写上工作序号和菌种编号

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琼脂稀释法药敏平板的制备 1
配制融化的MH琼脂或适合其他苛氧菌、厌氧菌等特殊细菌的培养基,待冷却到48-50℃,浇制药物平板。
取灭菌的90mm平板12只,用记号笔在平板底部作好“点种标记”、“药物名称”、“药物浓度”,浓度从ug/ml……128ug/ml,每种浓度1只平板共12个浓度系列。

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琼脂稀释法药敏平板的制备2
取11支无菌玻璃试管(13Χ100mm),每支试管标记为:ug/m,并于上述每根管子中用无菌移液管加无菌稀释液

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琼脂稀释法药敏平板的制备3
将保存在≤-20℃冰箱中的1920ug/ml浓度的抗菌药物保存液取出融化后,用无菌移液管吸取加入到128ug/ml标记的平板内1ml
移液管内剩余的加入到960标记的试管内,混匀后再吸取加入到64ug/ml标记的平板内1ml
移液管内剩余的再加入到480ug/ml标记的玻璃试管内;混匀后再吸取
依次类推,直至最后一个ug/ml标记的平皿内加入1ml,则抗菌药物稀释完成

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琼脂稀释法药敏平板的制备4
准备2只无药的平板,作点种前和点种后质控对照
所有药物平板应保持表面干燥,不可有肉眼可见的水珠(可在35℃孵箱内倒置平板开盖烘干15-20分钟)

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琼脂稀释法药敏平板的制备5
如果需使用的药物平板为100Χ100mm的方平板,则
每根玻璃管内需加入的抗菌药物稀释液;
每次无菌吸管吸取的抗菌药物量应该为4.5ml
每只方平板应加入2ml抗菌药物试液
无菌吸管内应存留下与下一个浓度的玻璃试管内的稀释液进行充分混匀
药敏培养基应加入28ml

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测试菌液的点种1
预先将点种针和点种板高压灭菌,并在孵箱内烘干(52孔、100孔、或21孔)
将已调整好浊度(1-2Χ107CFU/ml)的菌液用微量加样器将菌液依次加入菌液点种板小孔内,并作好与药物平板相应的点种标记,一般每小孔内应加入菌液270ul。每批试验均须保留有质控菌位置和无菌菌液位置
用酒精棉球清洁多点接种器后,将点种针安装在多点接种器架子上,再将加好菌液的点种板安置上多点接种器的点种板位置上

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测试菌液的点种2
开启多点接种器进行点种,因每一根点种针直径约3mm,因此点种到药物平板上每点的菌液量约为2ul,所以接种量为104 CFU/点
点种时应先点种对照前的质控平板,然后从最低药物浓度开始点种依次点种到药物浓度最高的平板

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药物平板的孵育
上述接种好的平板应在室温下静置至接种点上的菌液被琼脂完全吸收,再将药敏平皿倒置,于35℃孵育16-20小时
如葡萄球菌苯唑西林和甲氧西林,则需33-35℃,绝对不能超过35℃,孵育24小时,阅读结果
万古霉素药敏试验的肠球菌和葡萄球菌等需孵24小时后,阅读结果
淋病奈瑟球菌需在5%CO2空气环境中孵育20-24小时,阅读结果

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结果阅读和判断
结果阅读时,平板应置于黑色不反光的表面上,记录的MIC是完全抑制细菌生长的最低抗生素浓度,单个菌落或接种物所致的轻微的不清晰现象可忽略不计。
如果在MIC判断终点附近持续存在或多个菌落,或者低浓度不长,高浓度生长;或者有俗称的跳管现象,就应该检查试验菌的纯度,有否污染菌生长,并尽可能重复试验。
按当年的CLSI/NCCLS标准判断结果。

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质 控 菌 株
质控菌株

药敏
其他
金黄色葡萄球菌
ATCC29213
+

大肠埃希菌
ATCC25922
+

大肠埃希菌
ATCC35218
+
产β内酰***酶
肺炎克雷伯菌
ATCC700603
+
产超广谱β内酰***酶
铜绿假单胞菌
ATCC27853
+


第二十

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上传人:350678539 2022/1/22 文件大小:1.49 MB

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