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基因工程课程设计
题目：基因工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中的应用
：王晓红学号：20213027

年级：10级3班 2003年，Young等报道了一种有目的地扩增突变链的定点诱变技术(Targeted amplification of mutant strand，TAMS)。该技术能够一次引入多个位点的突变，并且能够有目的地扩增突变链，从而使突变效率几乎到达100％。
定点突变技术已在蛋白质的结构和功能改造上取得了很大成功。例如，利用定点突变改变酪氨酰-tRNA合成酶的活性中心，从而使酶活力提高了50倍；此外，在T4溶菌酶中参加二硫键，显著提高了该酶的稳定性。
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DNA聚合酶在进行扩增目的DNA时会以一定的频率发生碱基错配，这一现象恰好提供了一种对特定基因进行随机诱变的可能方法。利用PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因随机诱变的技术就称为易错PCR(Error_prone PCR，简称EP—PCR)。此方法的原理与操作如图3，其操作过程是在Taq DNA聚合酶催化的PCR反响体系中，利用Mn替代天然的辅助因子Mg，使Taq DNA聚合酶缺乏校对活性，同时使反响体系中各种dNTP的比例失衡，因此导致碱基的错配率大大增加，％。另外，还可以在该反响体系中参加dITP等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平。这种方法可以将错配率最大提高至20％。孔荣等利用易错PCR使D-；，/L，在pH>。
DAN重排
DNA重排(DNA shufling)技术是一种利用重组文库的体外定向进化技术，Stemmer于1993年首先提出。
Figure 4 The principle and operation process of DNA shuffling Zhao等在此根底上创造了一种更加简化交叉延伸程序( STEP)。此技术是在一个PCR反响体系中以2个以上相关的DNA片段为模板进行PCR反响。引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性、短暂复性(延伸)过程。在每一轮PCR循
环中，那些局部延伸的片段可以随机地与含不同突变的模板进行杂交，使延伸继续，并由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复进行直到获得全长基因片段，重组的程度可以通过调整时间和温度来控制。此方法省去了将DNA酶切成片段这一步，致使DNA重排方法进一步简化。
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近几年来，提高DNA重排技术捕获变异的能力一直是研究人员努力的方向。Ostermie等以核酸外切酶Ⅱ代替DNaseI对靶序列进行消化，创造了递减法建立杂交酶技术〔ITCHY)，使得非同源性序列间也能发生重排，扩大了该技术的用途。Hiraga等开发的SISDC技术在组件内部引入了限制性内切酶识别标记，用相应的限制性内切酶代替DNase I产生重排片段。Bergquist等开发的DOGS技术那么是根据保守模体区序列特征设计简并引物，扩增出保守同源区后再用重排操作生成突变富集体。由于此方法是在突变耐受的保守区直接增加转辙组的几率，所以其产生的突变频率大大增加。
DNA重排的最大特点是在反复突变过程中引进了重组这一自然进化中最重要的过程，而且其对可操作的靶序列的长度没有任何要求，可以到达几万kb。通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高，同时还打破了传统物种之间由于生殖隔离导致不能重组的界限。

基因组重排(genome shufling)技术是受DNA重排的启发，于2l世纪出现的全基因组改组技术。这种技术将分子定向进化的对象从单个基因扩展到整个基因组，可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合。首先，利用经典的诱变育种技术获得含有目标性状的基因组库，然后利用原生质体融合技术将这些发生正向突变的菌株的全基因组进行多轮随机重组，从而快速筛选表型得到较大改良的杂交菌种。该技术巧妙地采用了多轮循环原生质体融合技术，将各种亲本制成原生质体-融合-再生-再制成原生质体-融合-再生)，即递归原生质体融合(recursive protoplast fusion)的方法。Zhang等于2002年首次报道应用基因组重排方法快速地使弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)产生泰乐菌素的能力得到提高。该方法以营养缺陷型为出发菌株，仅用了1年时间，通过两轮基因组改组就从24