文档介绍：Real-time PCR
Introduction to Real-time PCR
迄今最灵敏最准确的核酸定量检测技术
Real time PCR
Fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR)
Classical PCR -end point analysis
常规PCR基于产物扩增终点分析
凝胶电泳分析
5’
Template
Cycle 1
5’
2X Template
4X Template
30-40 cycles
Cycle 2
5’
5’
5’
5’
对目的基因的有无进行定性分析
Real-Time PCR Chemistries
对样品中目的基因的初始量的多少进行定量检测
反应体系中引入荧光素
—每种荧光素都有一个最适激发光波长和发射光波长
荧光信号的强度增长与扩增产物的积累成正比
实时监测荧光信号
FAM
490nm
530nm
VIC
530nm
570nm
Real-Time PCR Chemistries
核酸染料技术 SYBR®Green I
SYBR®Gold
LCGreen®
Ethidium Bromide
EvaGreen®
荧光杂交探针技术 TaqMan Probe™
Molecular beacons
ScorpionsTM
AmplifluorTM
LUXTM
dual-oligo FRET pairs
SYBR Green I 与dsDNA结合
SGI 与dsDNA结合后受激发荧光强度增加1000倍.
Real-Time Chemistry: SYBR Green I
SYB
l
5`
3`
5`
3`
SYB
SYB
SYB
l
l
l
5`
3`
5`
3`
35℃
95℃
55℃
72℃
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
Real-Time Chemistry: SYBR Green I
Real-Time Chemistry: SYBR Green I
5’
Template
Cycle 1
5’
2X Template
4X Template
30-40 cycles
Cycle 2
5’
5’
5’
5’
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
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SYB
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SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
SYB
Melting Curve Analysis using SYBR Green
样品温度升高,dsDNA变性释放出SGI,使得体系中荧光信号减弱。
温度到达产物Tm时,荧光减弱最快。
温度升高
Tm
DNA 变性
Melting Curve Analysis using SYBR Green
荧光值变化率为纵坐标,温度为横坐标作图,得到一个波峰,对应温度为Tm.
Tm