文档介绍:物品准备
3 M 醋酸钠:
, g置于200ml烧杯中;加入40ml去离子水搅拌溶解;;加去离子水到100ml,高压灭菌,室温保存。
Solution I:
配成含50mmol/L葡物品准备
3 M 醋酸钠:
, g置于200ml烧杯中;加入40ml去离子水搅拌溶解;;加去离子水到100ml,高压灭菌,室温保存。
Solution I:
配成含50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris·HC1(),10mmol/L EDTA()。
1 M Tris-HCL (Ph ) 25 ml, M EDTA(Ph ) 20 ml,20% Glucose() 45 ml,dH2O 910 ml。高压灭菌,4℃保存,使用前每50ml Solution I中加2ml的RNase A(20mg/ML)。使其终浓度为100 ug/ml。
Solution II:
NaOH(用10mol/L的NaOH贮存液现用现稀释),2%SDS(用10%的SDS贮存液现用现稀释)等体积混合。
或者:10% SDS 50 ML(终浓度1%,W/V),2 N NaOH 50 ML(终浓度200Mm),使用无菌水定容到500 ML,室温保存,有效期一个月。
Solution III:
5mol/,,,过滤消毒。
或者:乙酸钾,147g(终浓度3mol/L),冰醋酸( ml)(终浓度5M),定容至500ml,高压灭菌,4℃保存。
10mg/ml RNase:
将10mg的RNase溶解于1ml的含10mmol/L Tris·Cl(),15mmol NaCl溶液,100℃加热15min,室温冷却,分装后-20℃保存。
STET:
配制成10mmol/L Tris-CL(Ph ), mol/L NaCL, 1 mmol/L EDTA (Ph ),5%(V/V)Triton X-100。,不需灭菌。
5mol/L LiCl:
g LiCl溶解于去离子H2O并定容至100 ml,高压灭菌。
TER:
即含20μg/ml RNase的TE
mol/L NaCl[含13%PEG8000(W∶V)]:
碱裂解法大量提取质粒DNA并用PEG进行纯化(200ml,如加量则相应增加)
(1)挑取单菌落接种于5ml含Amp的LB液体培养基中,37℃培养8~12小时。
(2)取上述新鲜培养物小提质粒鉴定后,剩余的菌液接种于含Amp的200ml LB培养基中,37℃培养12~。
(3)用50ml离心筒收集菌液(40ml×5×3),4℃、5,000 rpm离心10分钟,弃上清。
(4)用 8 ml×15预冷的STE重悬菌体,并将各自的菌归为一管,5,000rpm离心5分钟,弃上清。
(5)用4ml预冷的溶液I重悬菌体,加入8ml新鲜配制的溶液II,轻轻颠倒混匀;再加入6ml预冷的溶液III,轻轻颠倒混匀,冰浴10分钟。
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