文档介绍：实验五碱性磷酸酶米氏常数的测定
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一、目的要求

（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和
⑧ 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖
⑨ 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A
⑩ 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数
实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。
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五、操作方法
（一）对硝基苯酚标准曲线的制作
取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：
管号 0 1 2 3 4 5 6
pNP含量 (mol) 0
mol/mL pNP (mL) 0
H2O (mL)
Na2CO3-NaHCO3 (mL) mL
20 mmol/L MgCl2 (mL) mL
mol/L NaOH (mL) mL
OD 405 nm 
以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。
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(二）测定
15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。
No. 1 2 3 4 5
底物终浓度[S] (mM ) 3
10 mmol/L pNPP（mL ）
蒸馏水（mL ） 0
碳酸盐缓冲液（mL ） mL
20 mmol/L MgCl2 （mL ） mL
预热混匀，37℃，5分钟
酶液（mL ） mL酶液
反应时间 37℃，精确反应10分钟
mol/L NaOH（mL）各加2 mL
酶液（mL ） mL酶液
OD405
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（三）数据处理
各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数),计算出各种底物浓度下的初速度vo（单位以molL-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度Vm。
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六、注意事项
取液量一定要准确。
反应时间一定要精确。
加酶前后一定要将试剂混匀。
空白对照一定要先加NaOH，后加酶。
测定OD405时要以各自的空白调零点。
移液管或取液器的使用
比色杯的使用
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