文档介绍：免疫组化双重或多重标记
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操作的原则和要求基本上与单标免疫组化方法雷同 优点：不同抗原成分位置、功能关系更直观 缺点：流程长 脱片机率更高 前后重染色 HRP(DAB):AP(-坚固蓝)
HRP(4CN):AP(-坚固红)
直接法、间接法、桥法均可使用
灵敏度以桥法中的复合物法最高
特异性则以直接法最佳
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操作方法类同单酶标记，有直接法、间接法、复合物法之分。
间接法与复合物法较常采用。
★操作举例 淋巴瘤轻链κ、λ的双重酶标记（双酶双底物）
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(1)石蜡切片常规脱蜡进水（若用含***%碘的乙醇溶液脱***5min，乙醇浓度为70％，经自来水洗后，%硫代硫到钠浸洗1min，水洗)；
(2)% H2O2甲醇液浸泡切片30min,自来水洗，蒸馏水洗,入PBS( );
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(3)滴加正羊血清1:10，湿盒，室温，10min，不洗；
(4)加一抗(抗人κ PcAb与抗人λMcAb的混合液)1:200，湿盒，37℃，45min或更长；
(5)PBS液，5min×3
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(6)加二抗(GARG＋GAMG混合液1:200)，温盒，37℃，30min；
(7)PBS洗，5min×3;
(8)加酶抗酶抗体复合物(兔PAP＋鼠APAAP 混合液1:100)，湿盒，37℃，30min；
(9)PBS洗，5min×3；
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(10)过氧化物酶显色反应：以DAB- H2O2液显色 7～10min(镜下控制显色程度)，PBS洗，5min×3；
(11)硷性磷酸酶显色反应：(fast blue)显色10～15min(镜下控制显色程度)，PBS洗、自来水洗；
(12)缓冲甘油封片，光镜下观察
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P
P
P
A
A
A
κ λ
图2 双酶双底物(复合物法)双重酶标染色原理
兔PAP
GAR IgG
兔抗K
Ag
鼠APAAP
GAM. IgG
鼠抗人
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注：若用同种动物抗血清分别进行标记染色时，尚需考虑在前后重染色之间是否设置“多聚甲醛蒸气处理2-4h（封闭固定）---盐酸溶液处理2h（酸洗脱）的操作步骤”，目的为了避免前后重免疫试剂间的交叉反应。可视预实验结果来确定。
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（三）双重及多重免疫金标记(电镜）
电镜下的双重免疫标记染色不是靠颜色区分，而是靠标记物的不同电子密度或颗粒的不同大小来区别不同抗原，有别于光镜下的双重免疫标记方法。
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常用的方法多为双重免疫金标记
优点：高电子密度，分辨率高，抗原定
位精确，颗粒大小可人工控制，
标记试剂易制备。
缺点：试剂质量要求高，非特异吸附干扰
大(背景)
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金标抗体双重抗原标记常用间接法显示，且多采用异种动物抗体混合同步操作。
优点：敏感性提高，操作步骤减少
缺点：标记二抗质量要求高，背景染色深。
可通过采用固相吸附或过量二抗封闭，或用多聚甲醛蒸气处理，使二抗的游离抗原结合部位（Fab段）灭活加以克服。
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（四）其它双重标记法 (先酶标 后荧光) ； (先免疫金银标记后荧光标记) ； (20nm,红 色），此法忌用银液放大，易吸附干扰； (对比明 显)。
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三、注意事项 ，量少、脆弱先标记，量多、耐受后标记。 ，电镜样品一般忌用饿酸后固定，PG固定液中的戊二醛(G)浓度不宜超过2％，光镜样品的固定剂类型和固定时间的选择也应如此；
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，轻柔，洗涤应彻底，洗涤用的TBS中常加入1％ Triton×100或S