文档介绍：2022硕士研究生分子生物学实验讲义
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分子生物学实验讲义
〔硕士研究生试用〕
山西医科大学
根底医学院
生物化学与分子生物学实验室
质浓度 200 400 600 800 1000
〔μg /mL〕
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另取6支试管，编号为0～5，按下表操作
编 号 0 1 2 3 4 5
1号液 2号液 3号液 4号液 5号液
不同浓度蛋白质溶液〔mL〕 －
％NaCl〔mL〕 － － － － －
考马斯亮蓝试剂〔mL〕 5 5 5 5 5 5
蛋白质含量〔μg〕 0 20 40 60 80 100
混匀各管，室温下静置10分钟，于595 nm处进行比色。
绘制标准曲线：以A 595 nm为纵坐标，标准蛋白质含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
测定未知样品蛋白质浓度：
测定方法同上，取适量未知样品，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A
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595 nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白质的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度。
【考前须知】
在考马斯亮蓝试剂参加后的5－20分钟内测定光吸收，因为在此段时间内颜色最稳定。
测定中，蛋白—染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的，测定后可用乙醇将比色杯洗干净。
实验三 SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳
【目的要求】
-PAGE电泳原理及方法。
。
【实验原理】
十二烷基硫酸钠〔SDS〕—聚丙烯酰***凝胶〔PAGE〕电泳可根据蛋白质分子大小的差异别离蛋白质，并可测定蛋白质的相对分子量，其原理主要与电泳过程中存在的特殊物理效应有关：
1．凝胶的分子筛效应：聚丙烯酰***凝胶是在催化剂的作用下聚合而成的具有网状立体结构的微孔凝胶，蛋白质颗粒在电场中通过此凝胶时，会受到阻碍。大分子蛋白质受到的阻力大，电泳速度小，而小分子蛋白质受到的阻力小，移动快，因而最终在凝胶中得以别离。
2．电荷效应：SDS是一种外表活性剂，在蛋白
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样品和PAGE凝胶中参加SDS，那么能与蛋白质分子上的疏水基团结合，使蛋白质外表覆盖一层SDS分子。由于十二烷基硫酸根带有大量负电荷，且电荷量远远超过蛋白质分子原有的带电量，因而掩盖了蛋白质分子本身的电荷差异，使各种SDS-蛋白质复合物都带有均等密度的负电荷，分子之间的电荷差异消失。
3．变性效应：SDS同时还破坏了蛋白质中的非共价键，导致蛋白质变性，使SDS-蛋白质复合物在溶液中呈现相似的形状。因此，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于分子量的大小。在进行SDS-PAGE电泳时，同时使用蛋白质分子量标准样品，那么可以在电泳完毕后根据标准分子量大小得知样品蛋白质的相对分子量。
4．凝胶对样品的浓缩效应：SDS-PAGE使用一种不连续的缓冲系统，即分为低浓度的浓缩胶和较高浓度的别离胶，配制这两种凝胶所用缓冲液的pH值和离子强度也不相同。电泳时，样品中的SDS-蛋白质复合物首先经过浓缩胶，体积得到极大的浓缩，然后再经过别离胶被别离。
SDS-PAGE凝胶已经成为实验室常用的蛋白质别离方法，通常被用于蛋白质制品纯度的鉴定和蛋白质分子量的测定。
【试剂器材】
1．30%凝胶贮备液 称取 30g 丙烯酰***和N，N′-亚甲双丙烯酰***，用去离子水配制成100ml 的溶液，过滤，贮存于棕色瓶中，4℃冰箱保存。
2．10%凝胶贮备液 称取10g丙烯酰***和N，N′-亚甲双丙烯酰***，用去离子水配制成100ml 的溶液，过滤，贮存于棕色瓶中，4℃冰箱保存。
3．10% SDS 用去离子水配制，贮存于室温中。
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4．1% TEMED〔N,