文档介绍：DNA克隆
目的：建立繁殖目的基因的细胞系
含义：建立目的DNA分子繁殖体系的过程
三个要素: 目的基因、载体、受体细胞
涉及DNA分子体外重组；转化受体细胞
第1页/共58页
第一页，共59页。
分子克隆步骤
DNA源基因
整合质粒
装有整合促进基因整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上
穿梭质粒
含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制
表达载体
装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达
第12页/共58页
第十二页，共59页。
实验室常用质粒
pBR322
该质粒具有以下优点
分子大小4363bp，容易纯化;
含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记;
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。可以产生大量的重组pBR322分子。
质粒小、转化率高
质粒大、拷贝数低
﹥15kb 转化率成为限制因素
第13页/共58页
第十三页，共59页。
pBR322
该质粒具有以下优点
分子大小4363bp
含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下如氯霉素，可达到1000-3000拷贝。
实验室常用质粒
第14页/共58页
第十四页，共59页。
pUC系列载体
puc系列载体包括4个组成部分：
①来自质粒pBR322的复制起点
② 氨苄青霉素抗性基因
③大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(1acz)的启动子及编码α-肽链的DNA序列（1acZ’基因）
④1acz’基因5’端带有一段MCS，但它并不破坏lacZ’基因的功能。
在特定的受体细胞中可表现 α-互补作用，可通过 α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。
这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向相反
第15页/共58页
第十五页，共59页。
Figure . Map of plasmid vector pUC19. The origin of replication (ori) was derived originally from a ColE1-like plasmid, pMB1. The ampicillin resistance gene (ApR) was derived originally from the plasmid RSF 2124 and permits selection for cells containing the vector molecule. A portion of the lacZ gene is included and is expressed to give an amino-terminal fragment of β-galactosidase. This is complemented by a mutant lacZ gene in the host cell: the products of the vector and host cell lacZ sequences, although individually inactive, can associate to form a functional product. The 54 bp polylinker multiple cloning site (capital letters) is inserted into the vector lacZ (lower case letters) component in such a way as to preserve the reading frame and functional expression. However, cloning of an insert into the multiple cloning site (MCS) will cause insertional inactivation, and absence of β-galactosidase activity.
第16页/共58页
第十六页，共59页。
在特定的受体细胞中可表现 α-互补作用，可通过 α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。
第1