文档介绍：表观遗传学创新实验 5’-氮胞苷处理水稻幼苗对基因组 DNA ***化的影响庞劲松刘宝东北师范大学生物基础实验教学中心?表观遗传学与 DNA ***化? DNA ***化作用? DNA 的***化及其方式? DNA ***化的生物学意义? DNA 胞嘧啶***化的种类和形成? DNA 胞嘧啶***化检测?检测方法: MSAP , bisulfite sequencing ?5’氮胞苷处理对水稻 DNA ***化的影响?实验目的?实验材料?仪器?试剂?实验方法?5’-氮胞苷处理水稻幼苗?植物基因组 DNA 的提取与纯化?基因组 DNA 酶切-连接接头? PCR 扩增:预扩增,选择性扩增? PAGE 电泳?预期实验结果?注意事项与建议?思考题?参考文献?表观遗传学: ?不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变;主要包括 DNA 的***化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。?表观遗传变异包括: X-染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。?表观遗传变异的原因:是由于表观遗传密码的改变,如 DNA ***化、组蛋白的公家修饰改变等。? DNA ***化: 在 DNA 复制后,经 DNA ***转移酶( DMT )催化, 将 S-腺苷酰-L- 甲硫氨酸(SAM) 上的***基团连接到 DNA 分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上,进行 DNA 修饰的过程。? DNA ***化的方式?胞嘧啶***化?腺嘌呤***化 DAM (DNA 腺嘌呤***转移酶) 识别回文序列 GATC, 在此位置两条链的腺嘌呤 N-6 位置上同时***化,同时 SAM 转变为 SAH(S- 腺苷高半胱氨酸) 在 DMT(DNA ***转移酶)的作用下, CpG ( GG )位点胞嘧啶 C5 被***化 DNA ***化作用图 1 胞嘧啶***化过程图 2 腺嘌呤***化过程? DNA ***化的生物学意义?影响基因表达状态:通过该表基因调控区 DNA ***化程度调控基因转录图 3 ***化与基因沉默?参与基因组防御:通过高度***化而使外源 DNA (如转座子) 处于沉默状态?提高环境适应能力:在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型? DNA 胞嘧啶***化的种类和形成?从头***化( de novo methylation) ? DNMT3a , DNMT3b ?在完全没有***化的 DNA 上加上***。?维持***化(maintenance methylation) ? Met1 , DNMT1 ?较特异地识别半***化状态的 DNA ,负责在细胞分裂过程中依据 DNA 母链的***化状态给新合成的 DNA 链上加上***。图 4 两种胞嘧啶***化方式 DNA 胞嘧啶***化检测方法?使用对胞嘧啶 5’-***化状态敏感的限制性内切酶进行酶切处理,然后检测多态性: ?***化敏感扩增多态性(MSAP, Methylation Sensitive Amplification Polymorphism) ?胞嘧啶转化为其它碱基,然后对比测序: ?重亚硫酸盐测序(Bisulfite sequencing) GCmTACT 重亚硫酸钠 GCmTATT 测序测序?此外,还有单核苷酸法,***化接受力的检测法, CpG 岛分离法和基因活性测量法,基因芯片法等? MSAP ?用途: ?最常用的大规模检测基因组***化变异水平和位点的手段?原理: ?利用对 DNA ***化敏感性不同的同裂酶分别切割 DNA ,产生不同的酶切产物,同时将酶切产物添加接头,然后进行 PCR 扩增、 PAGE 电泳、银染, 产生可见的具有不同酶切型式的谱带,即可得知 DNA ***化信息。?***化状态分析: ?在不同泳道相对应的位置上,如果 Msp I酶切产物有扩增带、而 Hpa II酶切产物没有扩增带的,mGG ;若都有扩增带,说明此 GG 。还可以进一步对差异条带进行切胶回收、克隆、测序,以便得知发生***化变化的胞嘧啶的具体位置。?表 1 ***化敏感酶对不同***化状态 DNA 的切割结果原始序列 mGG CmCGG Hpa GG 不切割不切割 Msp m GG 不切割? MSAP 流程: 提取基因组 DNA (注意发育时期和成长状态相同) ……… GG m GG AC …………… GAACGG CCTG …… Msp I 酶切+接头 Hap II酶切+接头 GG m GG AC GG m GG AC TAGG GAACGG CCTG TAGG GAACGG CCTG PCR PCR PAGE 电泳 PAGE 电泳 Msp I5’… CC(m)G G … 3’3’… GG C(m)C … 5’ Hpa II5’… CCGG … 3