基因pcr扩增与检测课件PPT.pptx

文档介绍：基因pcr扩增与检测
基因pcr扩增与检测
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第2周
分子生物学试验仪器设备介绍和试验相关内容介绍
第3周
从植物组织提取DNA
第4周
从动物组织提取DNA
第5周
原核细胞质粒DNA提取
第6周
核酸琼基因pcr扩增与检测
基因pcr扩增与检测
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第2周
分子生物学试验仪器设备介绍和试验相关内容介绍
第3周
从植物组织提取DNA
第4周
从动物组织提取DNA
第5周
原核细胞质粒DNA提取
第6周
核酸琼脂糖凝胶电泳
第7周
紫外分光光度法测定核酸含量和纯度判定
第8周
限制性内切酶酶切质粒DNA
第9周
凝胶电泳回收和纯化DN***段
第10周
细菌感受态制备
第11周
质粒DNA转化
第12周
目标基因PCR扩增与检测
第13周
原核蛋白质SDS-PAGE电泳
第14周
考试
基因pcr扩增与检测
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一、 试验目标：
熟悉PCR方法体外扩增DNA基础原理，掌握PCR技术常规操作，了解PCR引物及参数设计。利用PCR扩增方法获取用于表示目标基因（CYP6B6）。
二、 试验原理：
PCR扩增是一个类似于DNA天然复制过程，以待增DNA为模板、在体外由引物介导酶促合成特异性DN***段方法。
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PCR方法体外扩增DNA基础原理图示
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预变性(双链DNA解链)
94C, 5min
变性(94C ,30s-1min)
复性（引物与单链DNA结合）
55C,30s-1min
延伸(72C,1-3min)
总延伸(72C,5-10min)
(25-35cycles)
PCR普通过程：
经过30次循环, 扩增DN***段可达100万倍以上。
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（1）引物长度应为15~30个核苷酸，Tm可按以下简单公式计算：
Tm=（G+C）x 4 +（A+T）+35- 2n
（2）引物中碱基分布应该是随机，防止出现一连串单一碱基或产生二级结构。
（3） G+C碱基含量在45%~55 %左右。
（4）两个引物在3 端均必须与模板互补，5端能够不互补。
（5）引物本身连续互补碱基小于4个。
（6）引物之间连续互补碱基亦应小于4。
引物设计普通标准
设计和选择高效而且特异性好引物是PCR关键
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循环参数：
①变性（denaturation）
变性是高温短时， 94C ，30s-1min。同时在第一轮循环前先进行94℃预变性5min，方便使模板DNA完全解链。
②退火（annealing）
实际使用退火温度要比引物Tm低5℃ 。 退火温度在55~72℃ 之间都会得到好结果。
③延伸（extension）
普通引物延伸是在72 ℃下进行。对2Kb长产品扩增时间多采取1min。
④循环次数（cycle）
普通为30个循环，假如循环次数过多会增加非特异性产物量。
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1、
55℃ *
30s
90s**
7min
45s
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1. eppendorf管，添加以下各种成份反应液
ddH2O µl
模板DNA µl（20-40ng）原质粒进行1：20倍稀释
上游引物(100µmol/L) µl
下游引物(100µmol/L) µl
dNTP mixture(10mmol/L) 2 µl
10倍×缓冲液 µl
Taq酶 µl
总体积 20 µl
2. 稍作离心，将反应管放入PCR仪中。
2、 反应体系: (CYP6B6)
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3. 设定反应程序：
94℃条件下使模板DNA预变性5min。
变性