文档介绍：酶联免疫吸附测定 （Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ）
免疫学教研室
实验酶联免疫吸附测定专家讲座
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抗原-抗体反应基本检测方法
凝集反应(agglutinati 洗液：PBST（PBS+%吐温20）
显色液：OPD（邻苯二***）
终止液/终：2M硫酸
鼠IgG(抗原)
兔抗小鼠IgG(一抗)
HRP-驴抗兔IgG(二抗)
免疫
Fc段
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操作步骤
包被：正常小鼠血清（IgG）包被，100μl/孔，4℃过夜
封闭：弃去包被液，加入5%脱脂奶粉封闭（ 200μl/孔），37℃,20min
弃去封闭液，用洗涤缓冲液（PBS/Tween20）洗板3次
加入一抗：加入不一样稀释度兔抗鼠IgG血清（ 100μl/孔），以200×起始，空白对照孔用洗液代替， 37℃,20min
洗板3次
加入酶标二抗：加入HRP-驴抗兔抗体（ 100μl/孔）， 37℃,20min
洗板3次
显色：加入底物,100μl/孔。室温避光显色5-10min;
2MH2SO4终止反应
结果判定
间接ELISA
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→
→
→
E
E
→
终止液终止显色
A,B两排一样操作，每孔加１００ul!
包被：1：5000稀释正常小鼠血清，4℃过夜
加酶标抗体：1:5000稀释HRP标识驴抗兔IgG抗血清， 37 ℃ 15min
加待检抗体：倍比稀释兔抗鼠IgG抗血清，37 ℃ 15min
洗涤：3次，1min/次
封闭：5%脱脂奶粉，37 ℃ 20min
终止液50ul
空白对照无显色
加底物液显色
底物液100ul
→
洗涤：3次，1min/次
洗涤：3次，1min/次
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A,B排上样完全相同：复孔
A
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2-12号每孔１00uL稀释液，
１号孔加入200uL一抗，从１号孔吸收100uL加到２号孔中，混匀，从２号孔吸收100uL加到３号孔中，混匀，．．．．．１１号孔吸收１００uL，丢弃！
每孔终体积100uL
无Ab,
仅稀释液
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病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒,SARS等
临床疾病诊疗中应用
蛋白质测定:各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标识物
非肽类激素测定：T3、T4，性激素测定
… …
ELISA在医学中应用
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ELISA在其它相关领域中应用
科研服务
食品安全
… …
环境卫生
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DH2+ H2O2 D+ 2H2O
DH2为供氢体， H2O2为受氢体。
DH2普通为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色产物。
酶催化底物液显色
E
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酶 /E
底 物/DH2
显色反应
测定波长
nm
辣根过氧化物酶 (HRP)
邻苯二***(OPD) 四甲替联苯***(TMB) 氨基水杨酸 邻联苯甲*** 2,2‘-连***基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
492
450
449 425 642
碱性磷酸酯酶(AP)
4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
黄色 红色
400 500
葡萄糖氧化酶(GOD)
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
黄色 深蓝色
405
420
β-Ｄ－半乳糖苷酶 (β-Gal)
***伞***基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
荧光 黄色
360,450 420
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