文档介绍：一、试验目标
经过本试验学****PCR反应基本原理，掌握PCR基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。
目的基因的PCR扩增
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PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技 1ul
引物2 (10pmol/ul) 1ul
Taq 酶(5U/l) ul
25 µl
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3、按下述循环程序进行扩增
94℃×3分钟，1个循环
94℃ ×30秒，56℃×30秒，72℃×1分钟，30个循环
72℃ 延伸10 分钟
4℃保温
4、扩增结束后取10μl扩增产物，%琼脂糖
电泳检测DNA扩增情况
四、试验步骤
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五、试验结果
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六、PCR反应条件优化
1、温度、循环参数：
（1）变性温度和时间：
确保模板DNA解链完全是确保整个PCR扩增成功关键。
加热90～95℃，30 ～ 60 s，再复杂DNA分子也可变性为单链。依据模板DNA复杂程度，能够调整变性温度和时间。普通情况下选择94 ℃ 30 ″，可使各种复杂DNA分子完全变性。
温度过高或高温连续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
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（2）复性温度和时间：
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板
结合。
复性温度选择，可依据引物长度和G+C含量确定，长度在15 ～ 25 bp 之间时，复性温度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 计算得到，普通位于40 ～ 60℃，30 ～ 60 s。
复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。
普通情况下选择55 ℃ 30″，足以使引物与模板之间完全结合。
六、PCR反应条件优化
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六、PCR反应条件优化
（3）延伸温度和时间：
普通位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃之间。
引物小于16个核苷酸时，过高延伸温度不利于引
物与模板结合，能够迟缓升温到70 ～ 75 ℃。
延伸反应时间，可依据待扩增片段长度而定，< 1Kb，1分钟足够；> 1Kb需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达15分钟。
延伸时间过长可出现非特异扩增，惯用72 ℃ 1′。
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（4）循环数：
其它参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA浓度。
理论上说20 ～ 25次循环后，PCR产物积累即可到达最大值，实际操作中因为每步反应产率不可能到达100%，所以不论模板浓度是多少，20 ～ 30次是比较合理循环次数。
循环次数越多，非特异扩增增加。
六、PCR反应条件优化
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2、MgCl2浓度：
可显著影响PCR产量及产物特异性
～ mM
过高：增加非特异扩增并影响产率
过低：酶活性显著下降。
六、PCR反应条件优化
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3、引物：
～ 1 μM
偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物
之间形成引物二聚体，产量降低。
偏低：产量降低。
引物设计标准：
总标准是提升扩增效率和特异性
六、PCR反应条件优化
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⑴ 长度15～30 b，过短特异性降低，过长则成本增加，产量也下降。
⑵ 引物碱基尽可能随机分布，防止出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G+C 含量宜在45 ～ 55%左右。
⑶ 引物内部不能含有本身互补序列，不然会形成发夹样二级结构，两个引物之间尤其在 3’ 末端不应有互补链存在，不然会形成引物二聚体。
七、引物设计标准
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七、引物设计标准
⑷ 引物碱基次序不应与非扩增区域有同源性(<70%)或少于连续8个互