文档介绍：细胞传代培养及细胞计数
人癌细胞系传代培养
1. 观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染；
：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体；
3. 漂洗：加1ml %胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消化液；
4. 消细胞传代培养及细胞计数
人癌细胞系传代培养
1. 观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染；
：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体；
3. 漂洗：加1ml %胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消化液；
4. 消化：再加1ml消化液漂洗1次,倒掉大部分消化液, ,室温放置3～5min；
5. 吹打：镜下看到细胞收缩变园, 加1～2ml含血清培养液, 用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫；
6. 计数：取样,计数,调整细胞浓度；
7. 接种及培养：按104 细胞/ml接种,37℃、5%CO2 ，饱和湿度条件下培养。
精品资料
你怎么称呼老师？
如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？
你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？
教师的教鞭
“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
注意事项
细胞生长至覆盖培养瓶底面积80%左右时,开始传代。
首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。
细胞混杂生长时, 可根据需要选择合适的方法纯化细胞。
血球计数板法
制备细胞悬液：细胞密度＞104/ml, 细胞过多时需适当稀释,单个细胞率>95%。
加样：混悬细胞，取少许细胞悬液，从计数池一侧加入，不要溢出或出现气泡。
计数：10倍物镜下计数四角大方格内的细胞，压线者只计左边线和上边线。
计算：细胞数/ml=（四大格细胞总数／4）×104×稀释倍数
细胞活力测定－台盼蓝染色法
制备单个细胞悬液：105～106／ml
染色：%台盼蓝染色1 min (9滴细胞悬液＋%台盼蓝)， 3min 内计数
计数：用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染料拒染）和死细胞（呈淡蓝色）
计算细胞活力：
活细胞率（％）＝［活细胞数／（活细胞数＋
死细胞数）］×100
细胞密度调整
稀释公式：C1·V1＝C2·V2
稀释前细胞密度C1，溶液体积V1
稀释后细胞密度C2，溶液体积V2
细胞计数
106/ml
Cell
susspension
105/ml
104/ml
103/ml
Medium
细胞生长曲线测定－计数法
DT = t × lg2 ÷ (lgNt－lgNo)
培养细胞的纯化方法
机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞
差速粘附法：成纤维样细胞，上皮样细胞
选择性酶消化法：金属管套取需要的细胞
密度梯度离心法：细胞漂浮密度，
Ficoll, Percoll
克隆化培养法：琼脂法，有限稀释法
免疫磁珠分离法：细胞表面标志，免疫磁珠
速度沉降法：细胞大小，离心淘洗技术
电泳分离法：细胞表面电荷
细胞培养过程中常见的问题
培养液pH值快速偏离 ：CO2浓度异常，培养瓶盖过紧 ；细菌、酵母或霉菌污染
培养液出现沉淀 ：细菌或霉菌污染
细胞不贴壁 ：胰酶过度消化细胞 ，支原体污染 ，缺乏附着因子
细胞死亡 ：孵箱中缺CO2 ， 孵箱温度不稳定 ，细胞冻融损伤 ，渗透压改变，培养液中毒性代谢产物堆积
细胞生长缓慢 ：培养液或血清改变 ，基本促生长成分的消耗、缺乏或降解,如谷氨酰胺、生长因子等 ，低水平的细菌或霉菌污染，接种细胞数太少 ，有限培养细胞衰老 ，支原体污染
谢谢！