实验一 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白.ppt

文档介绍：实验一 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白
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原理----电泳:带电颗粒在电场中泳动的现象
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量等不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。
不用支持物的
利用支持物
1）实验一 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白
第一页，课件共16页
原理----电泳:带电颗粒在电场中泳动的现象
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量等不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。
不用支持物的
利用支持物
1）纸电泳
2) 淀粉凝胶电泳
3) 琼脂糖凝胶电泳
4）醋酸纤维薄膜电泳
5）聚丙烯酰***凝胶电泳（PAGE）
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影响泳动速度的主要因素
1）电场强度：（越大，移动速度越快）
常压电泳：100-500V，2-10V/cm
高压电泳：500-10000V， 20-200V/cm
2）溶液的pH值：buffer。
3）溶液的离子强度： （I越大，速度越慢；缓冲 效果越好） ，-。
3）电渗现象：液体在电场中相对于固体支持物的相对移动。尽量避免有高电渗作用的支持物。
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聚丙烯酰***凝胶电泳（PAGE）
Davis 和Ornstein 1959年---人血清蛋白
聚丙烯酰***凝胶：由丙烯酰***（Acr，单体）和N,N′-甲叉双丙烯酰***（Bis，交联剂）共聚合而成（由过硫酸铵-四乙基乙二***TEMED系统或核黄素-TEMED系统激发）。
分子筛，可通过调节单体浓度或与交联剂的比例来控制孔径大小，达到不同的分离目的。
凝胶可以是平板（垂直板型）或柱子（盘状）
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SDS：十二烷基硫酸钠CH3（CH2）11OSO3Na，阴离子去污剂，与蛋白质结合，能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用，破坏蛋白质的二级、三级、四级结构。

1）先加还原剂如巯基乙醇打开-S-S-；
2）SDS破坏蛋白质构象，与氨基酸侧链充分结合，形成蛋白质亚基-SDS胶束。SDS是阴离子，使多肽链带上负电荷，该电荷量远远超过蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质之间的电荷差别。电泳迁移率主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。
SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰***凝胶电泳
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作 用
使蛋白质成为亚基物质，形成蛋白质-SDS胶束，消除蛋白质分子之间的电荷、形状差异；椭圆棒状，，长轴正比于蛋白质分子量。
MW在15200kDa，电泳迁移率与分子量对数呈线性关系。
logM=a-bRf，Rf为迁移率
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醋酸纤维薄膜电泳(CAME)
以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术，将血清样品点样于醋纤膜上，，血清蛋白质均带负电荷移向正极。
由于血清中各蛋白组分等电点不同而使表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。
电泳后，CAM经染色和漂洗，可清晰呈现清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白5条区带。
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人血清中常见蛋白质的等电点和分子量
蛋白质 等电点 分子量 正常参考值（%）
清蛋白 69000 57-68
α1-球蛋白 200000 -
α2-球蛋白 300000 -
β -球蛋白 90000-150000 7-13
γ-球蛋白 - 156000-300000 -
负极 正极
γ—球蛋白/β-球蛋白/α2-球蛋白/α1-球蛋白/清蛋白
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器 材
1．醋酸纤维薄膜(8X2mm) 2．点样器 3．染色皿，漂洗器，镊子  4．电泳仪：电泳仪电源，水平电泳槽
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试剂
1．巴比妥缓冲液( )：，，加蒸馏水加热溶解后稀释至1升。
2．氨基黑10B染色液：取氨基黑10B 0.