文档介绍：DNA抽取和质粒DNA制备
1
第一部分 DNA提取总论
2
一、提取DNA总的原则：
1 保证核酸一级结构的完整性；
2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度；
3 核酸样品中不应存在对酶有DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；
总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。
27
28
5、核酸的贮存——DNA保存
1）短期贮存：
4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。
TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，。
2）长期贮存：
TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴***仿可有效防止细菌和核酸的污染。
29
第二部分 基因组DNA的分离与纯化
30
一、DNA样品准备
常见的标本：
血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等
生物组织：
最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存
－ 70℃或液氮
31
二、DNA提取
（一）酚抽提法：
先用EDTA、 SDS 、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-***仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100－150kb。
32
DNA酚抽提法示意图
33
主要试剂的作用：
EDTA：1 二价金属螯合剂，抑制核酸酶；
2 降低细胞膜的稳定性
34
SDS的作用：
1 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂
溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸
释放出来
3 对RNA、DNA酶有抑制作用
4 与蛋白质形成R-O-SO3 ….R蛋白质复合物，使蛋白质变性
35
蛋白酶K：
水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质
蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能
力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可
同时使用
36
苯酚的特点：
蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性
苯酚溶于有机溶剂，微溶于水
提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降低DNA的损失率
氧化苯酚会破坏DNA
37
为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？
苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。
氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl饱和酚，并调节至中性。
38
，减少在蛋白质层滞留。
在酚或酚-***仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。
39
DNA的沉淀
1）无水乙醇沉淀
沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。
无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。
2）异丙醇沉淀
除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分子
40
（二） 甲酰***解聚法：
破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰***解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰***可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤
甲酰***解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右。
41
（三） 玻璃棒缠绕法：
用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb
42
DNA玻棒缠绕法示意图
43
44
（四） 表面活性剂快速制备法：用Triton X-100或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。
45
二、DNA的浓缩
1、固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋 外敷PEG至合适量
2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积
46
三、DNA回收
主要是从电泳中分离回收DN***段
回收原则：尽量提高回收率
去除回收DNA样品中的污染物
47
（二） 从聚丙烯酰***凝胶回收DN***段
（一） 从琼脂糖凝胶中回收DN***段
48
-纤维素膜插片电泳法
（一） 从琼脂糖凝胶中回收DN***段
49
电泳到DEAE-纤维素膜 ：
DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸附