基因的重组与转移.ppt

文档介绍：外源DNA
载体DNA
重组分子
原核细胞
真核细胞
扩增或表达
表达
连接
转化或转导
电穿孔或显微注射
受体细胞
第五章 基因的重组与转移
一、粘性末端的连接
DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸插入
（2）起始密码
尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。
ATGGAATTC
载体
ATGCGGAATTCT
插入片断
EcoRI
EcoRI
ATGGAATTC T
重组
但移码突变！
4. 防止载体自身环化连接
（1）提高插入片断的用量
连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。
（2）用碱性磷酸酶处理载体
载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。
5’
3’
载体
插入片断
1. 载体自身环化连接（能存活）
2. 载体之间互相连接（能存活）
3. 插入片段互相连接（不能存活）
4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活）
五、载体和外源DNA插入片段的连接结果
5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活）
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（1）转化（transformation)
大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。
（2）转染（transfection)
大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。
外源DNA导入细菌的几种方法
（3）转导（transduction)
借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。
第二节 重组体导入细菌细胞
外源基因导入细胞的方法
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1. 目的
增加受体菌细胞膜的通透性。
感受态大肠杆菌的制备
一、转化（transformation)
使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。
2. 菌种
用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。
3. 制备原理
4. 制备过程
培养大肠杆菌
-
On ice 5-10 min
4℃离心收集菌
用冰冷的60mMCaCl2重悬
4℃离心收集菌
4℃离心收集菌
分装、-70 ℃冻存
用冰冷的60mMCaCl2重悬
On ice 30 min
用冰冷的60mMCaCl2重悬
①生长状态
制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。
②必须在冰冷的条件下制备。
要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。
④储存感受态菌要在-70℃以下
③CaCl2处理
⑤使用感受态菌时必须迅速融化
融化后一般不能再次冻存使用。
感受态细胞 （competent cells)
每gDNA转化成功的细菌克隆数。
转化方法
转化率
简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。
（1）热休克法（heat shock）
转化效率高（高于109/gDNA）。
（2）电转化法
10ng载体DNA
100L感受态菌
On ice混合，静置10分钟
42ºC 1分钟
加入1mL LB培养基
37℃摇1小时
10-100L转化液涂含抗菌素的平板
吸附DNA
摄入DNA
（1）热休克法
LB培养受体菌至OD600=-
冰浴15分钟，2°C离心集菌
冰冷的水重悬菌体
2°C离心集菌
冰冷的水重悬菌体
2°C离心收集菌体
少量冰冷的水重悬
分装成
50-300L
,25F
脉冲控制器200-400
g质粒DNA
On ice混合
加入1mLSOC培养液
37°C中速震荡60分钟
10-100L转化液涂含抗菌素的平板
转化
（2）电转化法
4. 平板培养基培养细菌
10-100L转化液
涂于含抗菌素的平板
37℃过夜
把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。
二、体外包装的噬菌体的转导
（1）体外包装（in vitro packaging）
（2）转导（transduction）
通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。
cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。
但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。
（3）cI857基因突变的噬菌体
但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。
cI857
其它基因
溶源状态（DNA不转录、不翻译）
D