文档介绍：关于蛋白质的分离纯化与定性定量分析
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什么是蛋白质的分离纯化
分离：将蛋白质混合物分成单一的蛋白成分。
纯化：得到单一蛋白的纯品。
第二页，本课件共有100页
为什么要纯化蛋白质？
研究特定电基团。
第十八页，本课件共有100页
第十九页，本课件共有100页
Ion-Exchange chromatography
If pH mobile phase =
Then charge of the proteins: (-) (-) (+) (+)
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Anion exchange column = + charged
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Increased salt concentration
Ion-Exchange chromatography
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Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
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Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
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Na+
Na+
Na+
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基本操作过程
样品制备，装柱与平衡
上样（样品溶解于A液中）
洗脱：穿透峰，洗脱峰
收集、鉴定
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离子交换层析有两种洗脱方式
分步洗脱：用间断地递增的不同离子强度的流动相分次洗脱样品蛋白的方法；
梯度洗脱：连续改变流动相离子强度的方法。
目前随着层析的自动化，梯度洗脱成为大多数情况下的首选方案。
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分步洗脱
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梯度洗脱
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2. 凝胶过滤层析
利用分子量不同的蛋白质，通过凝胶分子筛时速度不同来分离蛋白质的方法。
固定相：凝胶颗粒（gel bead），多孔的网状结构，其网孔决定了凝胶的分级分离范围，即能被该凝胶分离的蛋白质混合物的Mr范围，如Sephadex G-50的分离范围是1500～30000。
常用的凝胶有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、Superdex等。
第二十六页，本课件共有100页
Size-exclusion chromatography
第二十七页，本课件共有100页
Size-exclusion chromatography
Absorbance at 280 is used to identify protein-containing fractions. You can also perform an enzyme specific assay.
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要根据待分离物质的分子量，选择特定的凝胶过滤基质；
凝胶过滤层析不仅可用于亲水性分子的分离，也可用于疏水性分子的分离，当用于疏水性分子分离时，该类层析往往被称为“凝胶通透层析”；
凝胶过滤层析可提供样品的分子量信息；
凝胶过滤的上样量一般在柱床体积的1～5％；
凝胶过滤的样品浓度越大越好，但一般不要超过100mg/ml。
凝胶过滤的注意事项
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第三十页，本课件共有100页
3. 亲和层析
以样品的生物活性为依据的分离方法。生物分子的特点是有专一的活性，如酶与底物的结合，抗原与抗体，激素与受体，糖与凝集素……等。
将上述作用体系的一方连接到层析基质上，使之固定化，就有可能分离纯化专一作用的另一方。
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Affinity chromatography
Makes use of specific binding interactions between molecules
1- Incubate crude sample with the immobilized ligand
2- Wash away non bound sample components from solid support
3- Elute
第三十二页，本课件共有100页
Commonly used affinity columns:
Ni2+  binds to poly Histines (example 6xHis)
Specific antibodies (anti-Flag