文档介绍：PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因制作人:江乐明制作人:江乐明1【【PCRPCR原理原理】】??聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是是一种一种选择性体外扩增选择性体外扩增DNADNA的方法的方法,其基本原理类,其基本原理类似于似于DNADNA的天然复制过程。的天然复制过程。??反应包括反应包括: : 变性变性(Denature) (Denature) 、、退火退火(Anneal)(Anneal)和延伸和延伸(Extension)(Extension)三个基本步骤。三个基本步骤。??这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的环将使目的DNADNA扩增一倍,这些经合成产生的扩增一倍,这些经合成产生的DNADNA又可作为下一轮循环的模板,所以经又可作为下一轮循环的模板,所以经2525~~3535轮循环就可使轮循环就可使DNADNA扩增达扩增达101066倍。倍。2加热加热变变性性复复性性复温DNADNA的变性和复性的变性和复性加热或强酸、碱性作用加热或强酸、碱性作用可以使可以使DNADNA双螺旋的氢键断双螺旋的氢键断裂裂,,双链解离双链解离,,形成单链形成单链DNA,DNA,这称为这称为DNADNA的变性的变性。。解除变性的条件后解除变性的条件后, , 变变性的单链可以重新结合起来性的单链可以重新结合起来,,形成双链形成双链,,其原有的特性和其原有的特性和活性可以恢复活性可以恢复,,这称这称DNADNA复性复性, , 也叫退火也叫退火。。3PCRPCR扩增原理扩增原理延伸延伸变性、退火变性、退火55’’33’’55’’33’’33’’55’’变性变性退火退火33’’55’’延伸延伸4??变性变性:加热,使模板:加热,使模板DNADNA在高温下(在高温下(9494℃℃)变性,)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段。双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段。??退火退火:溶液温度降至:溶液温度降至4545~~6565℃℃,模板,模板DNADNA与引物与引物按碱基配对原则互补结合,即退火阶段。按碱基配对原则互补结合,即退火阶段。??延伸延伸:溶液反应温度升至:溶液反应温度升至7272℃℃,耐热,耐热DNADNA聚合酶聚合酶以单链为模板,利用引物的以单链为模板,利用引物的33’’-OH-OH,以反应混合物,以反应混合物中的中的44种脱氧核苷三磷酸(种脱氧核苷三磷酸(dNTPdNTP)为底物,按)为底物,按55’’--33’’方向复制出互补方向复制出互补DNADNA,即引物的延伸阶段。,即引物的延伸阶段。PCR的三个热反应过程5温度(温度(℃℃))时间(时间(minmin))9494727260609494℃℃变性变性((1min1min))60 60 ℃℃退火退火((1min1min))72 72 ℃℃延伸延伸(())循环循环1 1 循环循环2 2 循环循环33PCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNA变性、变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。如此周而复引物退火和反应延伸三个步骤完成的。如此周而复始,重复进行,直至扩增产物的数量满足实验需求始,重复进行,直至扩增产物的数量满足实验需求为止。为止。6 PCR的产量?每一次循环后模板比前一次循环增加一倍。?DNA产量以指数上升,n个循环后,达到2n拷贝。7【【仪器耗材与试剂仪器耗材与试剂】】(一)仪器与耗材(一)仪器与耗材1. PCR1. PCR热循环仪热循环仪2. 202. 20μμLL、、200200μμL L 吸头,吸头,200200μμLL、、500500μμL L EPEP管,管,1010μμLL、、5050μμLL、、200200μμLL移液器移液器3. PCR 3. PCR 电泳仪和电泳槽电泳仪和电泳槽8(二)试剂(二)××PCR BufferPCR Buffer;;, 2, 25 mmol/L 25 mmol/L;;((其中包括其中包括dATPdATP、、dCTPdCTP、、dGTPdGTP与与dTTPdTTP;每种;每种浓度均为浓度均为10 mmol/L 10 mmol/L ););