荧光定量PCR实验报告.doc

文档介绍：荧光定量PCR实验报告
荧光定量PCR实验报告
荧光定量PCR实验报告
荧光定量PCR实验报告
目前需要检测抗癌药A在不用时间点对某抑癌基因B表达的影响,根据该药物在文献记录中发挥作用的时间点0小时,6小时,24小时给予药物,并已提荧光定量PCR实验报告
荧光定量PCR实验报告
荧光定量PCR实验报告
荧光定量PCR实验报告
目前需要检测抗癌药A在不用时间点对某抑癌基因B表达的影响,根据该药物在文献记录中发挥作用的时间点0小时,6小时,24小时给予药物,并已提取各时间点细胞的总RNA,请设计相关实验来检测药物A对基因B转录水平影响。
一、实验原理
所谓实时荧光定量PCR技术,就是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针与荧光染料。本实验主要采用SYBR荧光染料。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
二、实验试剂与器材
因RNA已提取,即应准备反转录与做PCR的试剂:
逆转录酶(M-MLV ),核糖核酸酶抑制剂(RNasin),dNTP,Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase),随机引物(Random primers),琼脂糖(agarose)均为美国Promega 公司产品;
荧光定量试剂盒:Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I) , BBI公司,合适的抑癌基因A的引物、β-actin引物。
器材:
ABI 7300 Real-Time PCR System
RS-28高速低温离心机
超低温冰箱
微量移液器
三、实验步骤
<1>,根据该药物在文献记录中发挥作用的时间点, 用抗癌药A在0小时,6小时,24小时给予药物,并已提取各时间点细胞的总RNA
<2>反转录(RT):
反转录反应液组成如下表:
Table 1 Mixed components for synthesis of cDNA first chain
Component
Volume(ml)
Concentration
5×R、T、buffer*
5
1×
dNTP
2、5
10mM/ ml
荧光定量PCR实验报告
荧光定量PCR实验报告
荧光定量PCR实验报告
RNasin
2
20U/ ml
RNA
5、3
8mg
Random Primer
1
0、1ug/ ml
M-MLV
6
5 U/ ml
Nucleasr-Free Water
3、2
Total
25
42℃反转录50min,95℃ 5min