文档介绍：高效液相色谱法在蛋白质 分离中的应用
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高效液相色谱技术特点概述
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HPLC系统各组分介绍；
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流动相的要求及准备过程
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HPLC色谱高效液相色谱法在蛋白质 分离中的应用
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高效液相色谱技术特点概述
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HPLC系统各组分介绍；
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流动相的要求及准备过程
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HPLC色谱技术与其他技术联用
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HPLC 应用举例
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现状与展望
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应用
范围广
高灵
敏度
高效
高压
分析速
度快
HPLC是近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论具有气相层析的全部优点。
特 点
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根据分离机理蛋白质HPLC又可分为
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高效凝胶过滤色谱(HPSEC)
高效离子交换色谱（HPIEC）
高效亲和色谱（HPAFC）
反向高效液相色谱（RP-HPLC）
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高效液相色谱仪
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常用的HPLC仪
Waters公司
Agilent公司
岛津公司等
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一 进样系统
进样方式
隔膜进样
*阀进样
自动进样
停流进样
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六通阀进样
高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。
上样
分析
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进样方式
部分装液法
进样量应不大于定量环体积的50%（最多75％），并要求每次进样体积准确、相同 。
缺点是易产生由进样引起的峰展宽
完全装液法
进样量应不小于定量环体积的5~10倍（最少3倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性
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二 输液系统
在线脱
气装置
梯度仪
高压输
液泵
输液系统
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高压输液泵
输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。其作用是将流动相以稳定的流速或压力输入到色谱系统。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性 。
流量稳定
流量范围宽
输出压力高
液缸容积小
密封性能好，耐腐蚀
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柱塞往复泵
流量不受柱阻影响
泵压可达400kg/cm2
输出的脉冲性较大，现多采用双泵
系统来克服
液缸容积小，，因此易于清洗更换流动相，特别适合再循环和梯度洗脱
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三 分离系统
分离系统
*色谱柱
连接管
恒温器
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色谱柱
柱效高
选择性好
分析速度快
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进入色谱柱样品的处理
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柱的使用和维护注意事项
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。
①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。
②应逐渐改变溶剂的组成 。
③一般说来色谱柱不能反冲 ，会迅速降低柱效。
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④ 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。
⑤ 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。
⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。
柱的使用和维护注意事项
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四 检测系统
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要求
灵敏度高
噪音低
适用范围广
重复
性好
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UV 检测器
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数据处理和计算机控制系统
恒温装置
在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准确地控制工作环境温度，柱子的恒温精度要求在±~℃之间，检测器的恒温要求则更高。
采集处理分析数据
控制
仪器
色谱系统优化
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流动相的要求
反相色谱流动相以水作为基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的非极性调整剂，常用的是甲醇和乙***。一般情况下甲醇-水已经能够满足多种样品的分离，粘度小，价格低。但推荐乙***-水做初始实验，与甲醇比，乙***的溶剂强度高粘度小，并可满足185-205nm处检测的要求。
与检测器相适应
溶剂的纯度
粘度小
沸点低固体残留物少
与色谱系统