文档介绍：奥沙利销对人宫颈癌HeLa细胞株的体外作用
【摘要】【目的】研究奥沙利钳对人宫颈癌HeLa细胞株的生长 抑制作用及对Caspase-3活性的影响。【方法】用人宫颈癌HeLa细 胞株经奥沙利钳处理后，MTT法测定细胞生长抑制率，透射电镜观察其机制的研究，国内外报道甚少。本实验通 过研究奥沙利钳对人宫颈癌HeLa细胞株的生长抑制作用及对 Caspase-3活性的影响，旨在为其在宫颈癌的临床应用提供实验依据。
1材料和方法
奥沙利钳由江苏恒瑞医药股份有限公司生产（No：06967）,用前以 无血清培养液配制。HeLa细胞株由兰州军区总医院中心实验室保存。 MTT为Sigma公司产品，用PBS配成5 mg/mLo RPMI-1640培养液为 GIBC0产品。胎牛血清：杭州四季青生物制品厂产品。原位末端转移 酶标记法（TUNEL）试剂盒（武汉博士德公司），EPICS XL型流式细胞 仪（Beckman Coulter公司），Caspase-3试剂盒购自凯基生物工程 公司。Caspase-3 阻断剂 AC-DEVD -CH0 购自 Phar Mingen 公司。
1. 2细胞培养
将HeLa细胞培养于含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基中 (
内含谷氨酰胺及100万U/L青霉素和链霉素)，置37 °C,体积分 数5%C02饱和湿度下培养，每2〜3 d传代1次,取对数生长期细胞用 于实验。
1. 3 MTT实验
采用MTT比色法，取对数生长期HeLa细胞(5X105/ mL), 24 h 待大部分帖壁后分别加入不同浓度的奥沙利钳(2 nmol/L, 4 n mol/L、8 pmol/L、16 umol/L、32 umol/L、64 umol/L、128 u mol/L, 256 nmol/L)，继续培养 24 h、48 h 和 72 h ,细胞对照 组每孔加入20 Li L培养液；空白对照组在铺孔时不加细胞悬液，只加 200 PL培养液。每个浓度各设3个平行孔，置37笆、5%C02培养箱 中分别培养后，加入5 mg/mL MTT 20 uL,继续温育4 h后吸弃上清, 加入二甲基亚＜(DMS0)150 PL,振荡10 min后，用自动酶标读数仪在 波长490 nm处测定各孔A值。实验重复3次，取3次实验结果的平均 值作为实验结果。按下列公式计算肿瘤细胞增殖抑制率：肿瘤细胞增 殖抑制率二(对照组吸光度A均值-实验组吸光度A均值/对照组吸 光度A均值)X100%o
1. 4电子显微镜观察细胞形态
取对数生长期HeLa细胞分别加入2个100 mL培养瓶中，使每瓶细 胞数为1X106个。1瓶为阴性对照，另1瓶加入奥沙利钳后最终浓度 32 nmol/L,
于37 °C、体积分数5%C02条件下培养48 h,调整经胰 蛋白酶消化后的细胞浓度至106/mL,加入20 g/L戊二醛固定后，由 电镜室按常规制备标本，在透射电镜下观察细胞形态并摄片。
(TUNEL)检测细胞凋亡
分组：对照组，草酸钳作用组(8 nmol/L, 16 nmol/L, 32 n mol/L, 64 nmol/L),每孔设4个复孔。把1 X 106/mL的HeLa细胞 分别接种于24孔板中，同时在每个孔中放置载玻片后，于37笔、5% C02下培养，爬片24h,按分组加药，加药结束后在48 h捞片。自 然干燥后用40 g/L多聚甲醛固定，进行TUNEL染色。TUNEL染色步 骤按TUNEL原位凋亡检测试剂盒说明书进行。光镜下观察凋亡细胞呈 棕黄色，阴性细胞呈蓝色。光镜下计算凋亡指数 (apoptosisindes, AI)。AI=凋亡细胞数/总细胞数X 100%。
将1 X106个HeLa细胞接种于6孔培养板,24 h待大部分贴壁后, 分别加入2种不同浓度的奥沙利钳，使其终浓度分别为8 nmol/L, 32 nmol/L,同时设对照组，各组设3个复孔。继续培养24 h后获取 细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，加入70%冷乙醇固定后重新收集细 胞,PBS洗去固定液，加入RNA酶反应过夜，与碘化丙唳(PI)染液混匀 后，上流式细胞仪检测细胞凋亡。
1. 7比色法检测Caspase-3活性
取对数生长期的细胞(2 X 105/mL),试验组加入不同浓度的奥沙利 钳，对照组不加药，培养24 h、48 h、72 h后收集细胞，PBS洗涤，冷 的 lysis buffer 悬浮细胞,置冰上20 min, 4 °C, 11 000Xg 离心 3 min, 测定上清液蛋白浓度，吸取50 PL含50-200 Pg蛋白的细胞裂解液 上清，力P A 50 u L reaction buffer