文档介绍：临床基因扩增检验操作标准
浙 江 省 基 因 诊 断 中 心
浙江大学医学院附属儿童医院
尚世强
一、临床基因扩增检验实验室的
标准化设置及其各室的功能
二、ITC处理的RNA标本在室温可保存7天
〔五〕标本的处理〔核酸提取〕
抑制物可能来源于：
标本本身〔如血红素及其前体或降解产物〕。
核酸提取过程中残留的有机溶剂〔如酚、***仿等〕。
痰须液化处理。
操作时〔加裂解液后充分混匀，沸水浴〕
注意：
①离心管不能插得过低，以防进水；
②水浴时不能加盖，防管盖爆开；
③水浴时间须准确，10±1 min；
④水浴时不能走开；
⑤左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器及操作仪器。
〔六〕靶核酸的逆转录〔RT〕和扩增
有多种因素可引起核酸扩增检测假阴性结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Mg++浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。
扩增仪孔中热传导的均一性极为重要。
RT-PCR操作注意：
①标本必须新鲜；
②做RNA标本的枪头离心管必须无菌；
③冰上操作；
④处理完后须立即上机，不能放置；
⑤注意左右手分开。
〔七〕扩增产物的分析
扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等。
实时荧光定量PCR
在荧光定量PCR根底上实时监测PCR全过程，最后通过曲线进行定量分析。
与一般荧光定量PCR使用荧光强度定量不同，实时荧光PCR一般使用Ct〔每个反响荧光信号到达设定域值所经的循环数〕定量，Ct与模板初始拷贝数的对数成线性关系。
实时荧光PCR的优点：
精密度高，重复性能好。
TaqMan荧光定量PCR原理
探针两端分别用荧光基团和淬灭基团标记，因为距离相近，基团相互作用，不产生荧光；
探针与模板杂交在引物区间内，当扩增进行时，Taq DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性降解探针，荧光基团和淬灭基团分开，受激产生荧光信号；
荧光信号强度与扩增产物量成正比；
三、PCR污染与对策
PCR污染分环境污染与反响液污染二种。常见PCR污染源有三个：
第一、标本间的交叉污染；
第二、实验室中克隆质粒的污染；
第三、PCR产物的污染〔Carryover〕。
要防止PCR污染，必须做好以下3个环节的工作：
〔一〕污染的预防
〔二〕污染源的追踪
〔三〕污染源的处理
〔一〕污染的预防
操作PCR时，按照下述规那么可有效地预防PCR的污染。
1、PCR的前处理及后处理要在不同的隔
离工作台上或房间内进行。
2、分装试剂，标记批号
3、改进实验操作：
(1) 带一次性手套；
(2) 防止反响液的飞溅；
(3) 用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于
空气，以免产物气溶胶污染；
(4) 操作多份样品时，要先将可混匀的成分
(dNTPs，缓冲液，引物等)一起制备标准
混合液(Master mix)；
(5) 制备反响混合液时，最后参加样品DNA，
参加DNA后，在进行下一步操作前要盖紧
反响管。
4、检查结果的可重复性。
〔二〕污染源的追踪
1、阳、阴性对照
选择阳性对照时，应选择扩增弱，
且重复性好 的样品。
阴性对照的选择一定要小心。
不含模板DNA的PCR试剂对照。
2、常见的环境污染源有
(1) 点杂交的点样器；
(2) 切片机；
(3) 离心机；
(4) 切胶用刀或微解剖刀；
(5) 浓缩用具，真空瓶；
(6) 电泳装置和紫外灯箱；
(7) 干冰/乙醇或水溶锅；
(8) 冰箱门把手、冷冻架和门把手。
追踪可疑的环境污染源
① 用去离子浸湿的灭菌棉签擦试可疑局部
② 去离子水中浸泡；
③ 取5μl 作PCR反响；
④ 电泳检查结果。
〔三〕污染源的处理
1. 环境污染处理法
〔1〕稀酸处理法。
对擦试实验阳性部位或器件可用1mol/LHCl擦洗或浸泡残留DNA。
〔2〕紫外法：
UV照射波长一般选择254/300nm，需考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布。UV对长片段〔500bp以上〕有效，而对短片段效果不大。