文档介绍：生物材料细胞生物学评价实验手册一、细胞培养技术(一)-DMEM,H-DMEM基础培养液700ml超纯水溶解一包L-DMEM培养基(内含10g粉末)或H-DMEM培养基(),,搅拌后定容至1000ml。(-7. 4)-DMEM,H-DMEM完全培养液L-DMEM基础培养液加入10%的胎牛血清,,4℃保存。×PBS(储液)称取:氯化钠50g,,,,加入约200ml水中,充分溶解后定容至250ml(-7. 4),室温保存。×PBS(工作液)取40ml25×PBS稀释25倍,即加超纯水定容至1000ml,高温灭菌。(调PH7. 2-)%/%胰酶/EDTA称取2. 5g胰酶,0. 4gEDTA溶解于约900ml1×PBS中,搅拌充分溶解后,4℃过夜。第二天,,定容至1000ml,0. 22μm过滤器除菌,4℃保存。-DMEM/H-DMEM基础培养液、胎牛血清和DMSO按照1:3:6的比例混和,。(1)脂肪诱导液(AI)在H-DMEM完全培养液加入终浓度为1μmol/L地塞米松、、100mmol/L吲哚美辛和10μg/ml牛胰岛素,,4℃保存。(2)脂肪保持液(AM)在H-DMEM完全培养液加入终浓度为10μg/ml牛胰岛素,,4℃保存。(OS)在L-DMEM完全培养液加入终浓度为0. 1μmol / L地塞米松、10mmol/L甘油磷酸钠和50mg/mlVitC,,4℃保存。+10ng/mLTGF-β3+50ng/mLIGF-1+20%%,加入油红O直至不再溶解,37℃水浴,加入更多的油红O,直至饱和,室温保存。,用10%,室温保存。附:成骨分化培养基储液的配制:(VitaminC)sigma公司产品(目录号是A4544)储液浓度是20mM,。配制方法是:,分装成1ml,-20℃保存。-glycerophosphatedisodiumsalt,pentahydrateCalbiochem公司产品,目录号是35675储液浓度是1M,使用浓度是10mM。配制方法是:,溶解于40ml超纯水中,溶解之后,定容至50ml,分装成1ml,-20℃保存。(dexamethasone)sigma公司产品,目录号是D4902或D1756。储液浓度是1mM,。配制方法是:秤取4mg,溶解于10ml无水乙醇中,分装成1ml,-20℃保存。成脂分化培养基储液的配制:(吲哚镁辛),sigma公司产品,目录号是I7378储液浓度是100mM,:秤取358mg,用10mlDMSO(sigma公司产品,目录号是D2650)溶解,,-20℃保存。,sigma公司产品。目录号是I6634储液浓度是5mg/ml,使用浓度是10μg/ml。配制方法是:秤取50mg,(将浓盐酸稀释1200倍),用一次性过滤器过滤除菌之后,,-20℃保存。注意:insulin使用时要注意保持insulin储液的无菌,经过除菌的insulin可在4℃冰箱放置半年以上。,sigma公司产品,目录号是I5879储液浓度是250mM,:秤取222mg,溶解于4mlDMSO,,-20℃(dexamethasone)sigma公司产品,目录号是D4902或D1756。储液浓度是1mM,使用浓度是1μM。配制方法是:秤取4mg,溶解于10ml无水乙醇中,分装成1ml,-20℃保存。(二)(hMSCs)骨髓取自非造血系统、非遗传性疾病且未累及骨髓的正常成人骨髓,一般20ml.(1)骨髓用1XPBS按1:1稀释(2)用吸管将骨髓缓缓加入含Ficoll-Hypaque(淋巴细胞分离液,/ ml)的无菌离心管中,两者体积之比是4:6。(3)离心,2000rpm×20min