文档介绍：PCR 扩增及 DNA 琼脂糖凝胶电泳
刘琳 1131428 环境科学
一、实验目的
1．学****并掌握 PCR 扩增的基本原理与实验技术。
2 ．对扩增后的 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。
二、实验原理
PCR ul 534 、 ul Taq 、 ddH 2O 的比例配置足量的 PCR 反应体系。
分别向 9 个薄壁管中分别加入 24 ul 的反应体系，并分别添加 8 种不同的模版，并于 第 9 个薄壁管中加入无菌 ddH2O 作为阴性对照。
将薄壁管放入 PCR 扩增仪中，按照预定程序进行 PCR 扩增。其中循环过程需要达到 30~40 次。程序如下：
预变性： 94C 3min
循环： 94C 变性 30s
55C 退火 30s
72C 延伸 30s
末次延伸： 72C 5min
PCR扩增完成后，将样品取出并保存于 15 C环境中。
DNA琼脂糖凝胶电泳实验
，放到一锥形瓶中，加入适量的 >TBE电泳缓冲液。然后置 微波炉加热至完全溶化，溶液透明。摇匀，待冷却至60C左右，在胶液内加入适量的EB。
，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至 60C左右的胶液，使
之形成均匀水平的胶面。
，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。
，至液面覆盖过胶面。取1卩缓冲液和5卩待测DNA 样品混合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。
，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过 5V/cm，开始电
泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。
（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约 1cm处，可停止电泳。
***仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜， 赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。
关上样品室外门，打开紫外灯，通过观察孔进行观察。
五、实验结果与讨论
如图所示：从左至右，分别是模版1-8 号，第9列为阴性对照。
前8列均有明显的条带出现，而阴性对 照无显示，说明扩增整体效果很好。图中有 上下两条线，上面一条线所覆盖的条带基本 可以代表扩增的产生的片段位置，参照图可 以看出扩增片段在200bp左右。在第9个阴 性对照的第二条线处可以看到较为模糊的条 带，并非是出现假阴性，而是由于二聚物而 产生的条带。通过该条带与最右侧的 marker 对比可知该片段出现在100bp左右，并非由 于实验操作等问题而产生的污染。
实验的照片显示实验结果有拖尾现象， 但是并不影响后续实验。在实验过程中由于 有些试剂加到了管壁上面，并没有完全加入， 可能会出现一些误差。另外在第1列条带中 出现了其他的亮带，可能是由于在前期的扩 增实验中滴加试剂时由于量过少而进行的摇 匀和融合等操作产生了非特异性扩增，也有可能是因为胶板制作过程中梳子的位置不合适 或者胶板制作时边缘处不够均匀导致产生污染。但总体而言，实验结果较为满意。
六、 实验注意事项
由于PCR技术非常敏感，可使一个 DNA分子得以扩增，装有PCR试剂的离心管 打开之前，应先在微量离心机上作瞬间离心使液体沉积于管底。 PCR扩增反应的条件，要 控制好