文档介绍：蛋白质工程第四讲分离纯化与分析
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一、分离纯化是分析的重要过程：
针对分析目的不同，对分析对象的要求和采取的措施不同。
若分析过程干扰很小，特异性很高，不需要对样品处理可直接测定。如：—)。
分析程序：点样，展层，显色。
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TLC 色素指纹图谱和灰度分析
图4 TLC色素指纹图谱的图像灰度分析曲线
Fig. 4 Intensity curve of pigment fingerprintings on TLC
图3色素的TLC指纹图谱
Fig. 3 Profile of pigments fingerprints on TLC
a, Once Developing Method. b, Repeated Developing Method
T1→T11
T11
T1-4
T10
T9
T8
T7
T6
T5
a
b
重复展层法：展层剂1为石油醚、正己烷、异丙醇、***和甲醇比例=8-10：-：-：-：- ；展层剂2为石油醚：正己烷：异丙醇：***，比例为10：：-：- 。
重复展层法呈现的TLC指纹图谱能将CQV97菌株全色素分辨成11条不同颜色条带的色素组分，从下而上依次为黄绿色、蓝绿、深蓝绿、绿色、紫色、黄色、黄色、紫色、红色、红棕色和橙黄色
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聚酰***薄膜薄层层析：
DNS—氨基酸分析，DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰***），
灵敏度10-9~10-10mol/L。DNS-Cl和氨基酸或多肽在特定条件下反应。
DABTH-氨基酸的薄层层析分析蛋白质序列。
Edman降解试剂DABITC（4-N,N-二甲氨基偶氮苯-4’-异硫***酸酯）进行微量蛋白质序列分析（2—10 nmol肽样品）。
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单向纸层析
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双向纸层析
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薄层层析
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（2）凝胶过滤：排阻色谱或分子筛层析，根据分子颗粒大小进行分离
原理：分子在筛孔中自由扩散、渗透，由于分子在筛孔中的分配系数不同，将分子分离。排阻的范围为0—100%。
分配系数：分离化合物在内水和外水体积中的比例关系。
Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)
Vt=Vo+Vi+Vg，Vt、Vo、Vi和Vg分别为床体积、外水体积、内水体积和介质的体积。
分离物质的大小，0< Kav <1， Kav=0或Kav=1，不能分离。
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常用介质：
交联葡聚糖（Sephadex G10—G200）； Amersham Biosciences
交联琼脂糖（Sepharose CL-4B,CL-6B）
Sephacryl S 系列（聚丙烯酰***-葡聚糖）
Superdex 系列 （高交联琼脂糖-葡聚糖）
Bio-Beads S-X系列 （苯乙烯-二乙烯苯）
Bio-Gel P系列 （聚丙烯酰***） Bio-Rad
Bio-Gel A系列 （琼脂糖）
TSKgel SW 系列 （硅胶）
TSKgel Toyopearl HW 系列，亲水性聚乙烯醇 Toyo Soda
TSKgel PW 系列 亲水性聚乙烯
TSKgel CW-35 纤维素
Cellulofine 纤维素 Chisso
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操作程序：
凝胶选择和处理（型号和粒度、凝胶用量、凝胶处理）
凝胶柱的制备（柱选择，径长比约为1:25—1:100，装柱、柱鉴定），
加样和洗脱（加样、洗脱、样品收集，检测）
凝胶柱的再生和保存
应用：
分离纯化，脱盐和浓缩，去热源物质、分析检测
（定性、定量、分子量）。
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（3）离子交换：电荷大小
阳离子交换剂：，羧***（-O-CH2-COO-）
阴离子交换剂：氨基乙级（-O(CH2)2-NH3+）
常用介质
DEAE（二乙***基以及）—Cellulose DE-23
DEAE—Cellulose DE-52
DEAE- Sephadex A-50（25）
DEAE-Sepharos CL-6b
DEAE-Bio-Gel A
CM- Cellulose DE-52
CM- Cellulose DE-32
CM- Sephadex C-25(50)
洗脱方式，梯度洗脱，线性和非线性洗脱
应用：物质