文档介绍：酶联免疫吸附分析
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第七章 酶联免疫吸附分析
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抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体较弱。
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用已知特异性
抗体包被
固相载体
测定管加待测抗原和
一定量的酶标抗原使二者与
固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原
与固相抗体直接结合
分别洗涤
除去未结合
的成分
加底物显色
分别测定两管的吸光度值，
根据对照管与测定管吸光度值之比，
计算标本中待测抗原含量
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ELISA特点一：灵敏性
该测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶。酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。
例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml 。
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特点二：特异性
其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。
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ELISA要有三个必要的试剂，即免疫吸附剂、结合物和酶的底物。
完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）； （2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）； （3）酶的底物； （4）系列参考标准品（定量测定）； （5）酶标记物及样本的稀释液； （6）洗涤液； （7）反应终止液。
二、ELISA试剂
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ELISA试剂盒
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ELISA试剂的作用
免疫吸附剂：
已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA方法中的核心试剂。
固相载体：
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。
良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。
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包被
将抗原或抗体固定化的过程称为包被(coating)。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。
抗体或蛋白质等抗原是通过物理吸附与聚苯乙烯等固相载体结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的相互作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。
载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。
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封闭
封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被固相载体表面剩余吸附位点的过程。
蛋白质抗原或抗体包被时所用的一般浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的吸附位点，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些吸附位点，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附，增加ELISA反应得专一性和灵敏度。
封闭的程序与包被过程相类似。%-%的牛血清白蛋白。研究表明，脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用（5%）。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。
现在学物
即酶标记的抗原或抗体，是ELISA中最关键的试剂。良好的酶标记物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。
酶标记物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记物中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。
此外酶标记物还要有良好的稳定性。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。
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酶的底物
、HRP的底物 HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的