文档介绍：分子生物学实验技术主讲:琚春梅 Tel : ********** 兽医微生物学与免疫学教研室第一章 RNA 的提取和 cDNA 的合成 RT-PCR 原理及应用提取总 RNA 以其中的 mRNA 作为模板反转录 cDNA PCR 作模板获得目的基因应用:基因检测、基因转录产物的分析、合成 cDNA 探针等一、 RNA 的提取? RNA 易降解,在提取过程中要严格防止 RNA 酶的污染,并设法抑制其活性。? RNA 酶稳定,并广泛存在,如各种组织、人的皮肤、手指、试剂、容器等。采取的措施: 1、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换(使用一次性手套)。 2、所用的玻璃器皿需置于干热灭菌箱中 200 ℃烘烤 2h以上。 3、不能用高温烘烤的材料,如塑料容器、试剂等可用 % 的焦碳酸二乙酯(DEPC) 水溶液处理, 然后高压灭菌以消除残存的 DEPC 。注意事项: 1、 DEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物。 2、 DEPC 能与氨基和巯基反应,因而含 Tris 和 DTT (二硫苏糖醇)的试剂不能用 DEPC 处理。 3、 Tris 溶液可用 DEPC 处理的水配制然后高压灭菌。 4、配制的溶液如不能高压灭菌,可用 DEPC 处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。总RNA 提取方法(试剂盒): 异硫***酸胍-苯酚法( Trizol 法) 原理: (1) Trizol 的主要成分是酚。主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。酚是有效的蛋白变性剂,但不能完全抑制 RNA 酶活性,因此 Trizol 中还加入了 8-羟基喹啉、异硫***酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase 。异硫***酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质,并使蛋白质二级结构消失,细胞结构降解, 核蛋白迅速与核酸分离。(2)***仿可使蛋白变性,降低蛋白的溶解度。其主要作用是分相,实际上是加速有机相和水相的分层。上层水相, pH 左右,当溶液 pH 在酸性的时候, DNA 分子就会沉淀在酚与溶液的界面,只有 RNA 分子留在水相。而当 pH 接近中性时, DNA 就会溶解在水相,(导致 pH 中性的原因可能是 trizol 与样品比例不对,应该尽量保证提取量的前提下使 trizol 过量)。***仿还可以去除植物色素和蔗糖。同时,***仿可以去除核酸溶液中的痕量的酚。(3)异丙醇作用是沉淀 RNA 。异丙醇沉淀,优点是容积小且速度快,主要沉淀 DNA 和大分子 rRNA 和 mRNA ,对 5sRNA 、 tRNA 不产生沉淀,所以 RNA 电泳的标志性三条带中 5sRNA 带很不清楚,未必是你的 RNA 降解。但是异丙醇难以挥发出去。(4)因为上述试剂会影响后续实验,所以用 75% 乙醇洗 1~2 次。一是乙醇可以溶解一些沉淀中可能的有机物杂质;二是洗掉异丙醇、***仿,乙醇易挥发,痕量的乙醇很容易挥发掉。 Yeast Total RNA