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乙型肝炎病毒感染的现状
，，其中每年约有1-2%会出现肝硬化或肝癌而死亡
HBV病毒颗粒感染肝细胞及DNA复制过程
何时可以停药（4）
HBeAg阴性伴HBV DNA活跃复制的慢性乙型肝炎患者，综合疗效完全应答者疗程至少2年；对于完成1年治疗仍无应答者可改用或加用其他有效 治疗方案
HBV-DNA定量— 治疗后的随访
无论有否治疗应答，都应对患者定期随访。建议停药后的前3个月每月1次、以后每3～6个月1次检测ALT、AST、HBV血清标志物和HBV DNA，以及临床表现和不良反应。随访至少6-12个月。如病情有变化，可随时随访。
HBV拉米夫定耐药
虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著，但长期使用拉米夫定会出现耐药现象
使用一年、二年、三年、四年的耐药比率为：15-32%、38%、56%、67%
一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变异），大多数患者会在2-4个月之内出现HBV-DNA和ALT反弹
YMDD变异检测
采用实时荧光定量PCR方法，不仅能够检测出现的突变类型（YVDD或YIDD），而且能够确定突变株所占比例，对及时调整治疗方案具有非常重要的意义
能够准确稳定的检测到1%的突变株，能够更早发现耐药突变，尽早调整治疗方案
HBV 拉米夫定耐药突变检测试剂原理
Primer F
Primer F
Primer F
Probe
Probe
Probe
Primer HBV
Primer YIDD
Primer YVDD
HBV检测
I突变检测
V突变检测
YMDD的定量检测
采用选择性引物，基于TaqMan实时PCR技术，在三个平行反应中分别扩增总HBV(C管）、YIDD（I管）、YVDD（V管），根据管间Ct值差异计算突变毒株在病毒群体中的比例
YMDD的定量检测
YMDD的定量检测
YMDD的定量检测
YMDD的定量检测
YMDD的定量检测
与其它方法的比较
Comparison of results obtained by sequencing, pyrosequencing and real-time PCR
Types Sequencing pyrosequencing real-time PCR
rtM204 25 (36%) 24 (35%) 23 (33%)
rtM204I 26 (38%) 24 (35%) 21 (30%)
rtM204V 18 (26%) 19 (27%) 20 (29%)
rtM204I + rtM204V 0 2 (3%) 5 (8%)
YMDD变异定性判断的临界值
定性判断：ΔCt < ，此时病毒群体中突变株比例大于10%
与测序法比较，15例标本结果完全符合
YMDD变异定性判断的临界值
什么时候开始检测YMDD变异
拉米夫定治疗过程中YMDD变异情况
治疗时间 HBV DNA大于104copies/ml例数 YMDD变异例数*
< 6个月 6 1（17%）
6~12个月 26 14（54%）
12~24个月 38 26（68%）
24~36个月 38 38（100%）
* 各组之间两两比较均有显著差异（P<）。
YMDD变异株的动态变化
YMDD变异株的动态变化
YMDD检测试剂—应用方法
对接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者进行耐药监测
治疗前检测一次（约有10-20%的人在治疗前就有YMDD变异）
治疗开始后第七个月开始，每三个月检测一次
拉米夫定耐药、替比夫定耐药（YIDD）
恩替卡韦治疗YMDD变异患者存在耐药高风险
慢性乙肝的基因分型
乙肝病毒分八个基因型：根据基因组序列的差异可以分为A～H八种亚型，我国以B型（41%）和C型（53%）为主
不同基因型病毒感染的病程和后果不同：C型对肝的损伤比B型严重，基因型C比基因型B更容易发展成为肝硬化
不同的基因型对药物的应答也不一样：基因型B比基因型C对干扰素治疗的应答率高
HBV基因分型PCR检测试剂
运用多重、多色实时PCR技术，分别对乙肝病毒（HBV）各种基因型序列进行分析
根据国内HBV基因型的特点，设计能检测HBV A~D四种基因型特异性引物及探针
研制开发具有自主知识产权的乙肝病毒（HBV）基因分型多重、多色实时PCR检测试剂盒
HBV基因分型— 结果判断方法
B管（Ct<36）