文档介绍：葡聚糖凝胶柱的使用方法
葡聚糖凝胶柱的使用方法：（1）预处理
称取Sephadex G-25（50,100目）约5g,加入蒸储水100ml,置室温下3h进行溶胀。
（2）装柱
凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为 1:15。柱的底部ex-G-25)
【实验操作】
实验凝胶的制备: 商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，称取 4 克
葡聚糖凝胶G— 25，加50 毫升蒸馏水，搅拌均匀，在室温溶胀6 小时，或沸水浴
溶胀 2 小时，一般采用后一种方法。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用
蒸馏水反复洗涤几次，再以缓冲溶液（的 Tris —醋酸溶液）洗涤2—3次，使
pH和离子强度达到平衡，最后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，凝胶可保存在缓冲
液内。
装柱 : 将层析柱洗净，垂直固定在铁支架上，选择有薄膜端作为层析柱下
口，将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧。层析柱中加入洗脱液，打开下口螺旋夹，
让溶液流出，排除残留气泡，最后保留约 2 厘米高度的洗脱液，拧紧螺旋夹。将凝
胶轻轻搅动均匀，用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中，待凝胶沉积到柱床下已超
过 l 厘米时，打开下口螺旋夹，继续装柱至柱床高度达到 8 厘米 , 关闭出口。装柱
过程中严禁产生气泡，尽可能一次装完，避免出现分层。再用洗脱液平衡l 至 2 个
柱床体积，凝胶面上始终保持有一定的洗脱液。平衡后，拧紧下端螺旋夹。
加样品 : 打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出，直至床面与液面刚好平齐为
止，关闭下端出口。取溴酚蓝及蓝色葡聚糖— 2000混合液毫升，小心地加于
凝胶表面上，切勿搅动层析柱床表面。打开下端出口，使样品溶液进入凝胶内，并
开始收集流出液。当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭下端出口。用少量
洗脱液清洗层析柱加样区，共洗涤三次，每次清洗液应完全进入凝胶柱内后，再进
行下一次洗涤。最后在凝胶表面上加入洗脱液，保持高度为3—4cm。
洗脱与收集: 连接好凝胶柱层析系统，调节洗脱液流速为每分钟 1 毫升，进
行洗脱。仔细观察样品在层析柱内的分离现象，收集洗脱液，每收集3 毫升即换一
支收集管（试管预先编号），收集约 20 管左右，样品即可完全被洗脱下来。将各收
集管中的洗脱液分别用 721
型分光光度计在波长540nm处测定其光密度。
凝胶回收处理方法 : 将样品完全洗脱下来后，继续用三倍柱床体积的洗脱液
冲洗凝胶后，将柱下口放在小烧杯中，慢慢打开，再将上口慢慢松开，使凝胶全部
回收至小烧杯中，备用。
Sephadex LH20 的原理。
Sephadex LH20 的分离原理主要有两方面: 以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配
的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗
脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex
LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下
来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤
作用来分离。
Sephadex LH20 洗脱溶剂。
看完第 2 点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类: 反相和正相
两种。用得