文档介绍：免疫共沉淀研究生实验课
背 景
据估计，人体中大约总共可产生500,000种蛋白，而单个细胞可以产生 10,000 种。
在这些蛋白中，80%不是以独立的方式存在的，而是存在于一个蛋白复合体中。
蛋白-蛋白的互相作用包含在一个细AKT兔抗人多克隆抗体10 μ l，4℃ 转鼓过夜(10min)；
孵育液体积的控制：考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多那么就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲液太少那么不能溶解抗原，过多那么抗原被稀释。
参加35 μl Protein A agarose，4℃转鼓转2h (10min) ；
1000g 4℃ 离心5min，PBS洗3次，参加40μl 2×SDS Sample Buffer〔125mM Tris•Cl , 4%SDS, 20%Glycerol, 100mM DTT, %溴酚蓝〕沸水浴中煮沸5min；
Western Blot检测样品，剩余样品-20℃保存。
抗体的选择：
1. 使用明确的抗体：实验最需要注意的就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合才能也不同，免疫细胞化学染色能结合未必能用在IP反响。仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题，确保共沉淀的蛋白是由所参加的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于防止污染的发生；
：
单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗
兔多克隆抗体：正常兔IgG
3. 抗体用量的控制：1-4μg〔通常用2 μg 〕
4. 确定蛋白间的互相作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进展蛋白质的定位来确定。
优 点
互相作用的蛋白都是经翻译后修饰的，处于天然状态；
蛋白的互相作用是在自然状态下进展的，可以防止人为的影响；
可以别离得到天然状态的互相作用蛋白复合物。
缺 点
可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质互相作用
两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；
如用western blot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，假设预测不正确，实验就得不到结果〔但假如结合质谱检测就可以分析所有的结合蛋白的种类〕。
通过质谱确定捕获的蛋白
结果分析
盐离子浓度影响coIP结果 很多蛋白复合体对盐浓度敏感，但敏感性有强弱之别。通常来说，真实存在着的蛋白复合体能耐受生理盐〔〕或更高浓度，即在生理盐浓度下不会解体。详细如，某种CDK和Cyclin其结实程度能耐受以上的高盐而不解体。因此，理解一个蛋白复合体对盐浓度的耐受，既是一个帮助判断蛋白复合体是否真实存在的一个重要根据，更是一个非常重要的生化数据；对某些体外生化反响的蛋白原料的纯化制备也是很重要的辅助根据。在生理盐或更低盐浓度下进展coIP可能增加假阳性几率—很多蛋白间非特异性的黏粘被记录下来。通常选择做细胞裂解。纯化蛋白通常选取以上进展IP。
2. 过表达 血清中丰富的BSA可以被任意抗体识别〔其实也是一种互相作用〕，同理高丰度的两种或多种蛋白人为拼凑到一起，也可以非特异性的黏粘或者发生弱的互相作用。
3. 不添加NP40一类外表活性剂，削弱对非特异性结合的拮抗 NP40除可以在膜上穿孔外，也可以有效拮抗非特异性的蛋白互相作用，进步coIP的特异性。
-%。
-%时，染色体很容易析出，造成样品过粘而需要超声。
4. 超声和冻融的影响
很多市售或自制的裂解液过于温和，需要考虑采用机械或者超声等手段进步裂解效率〔超声要慎用，可能破坏弱的互相作用〕。
但是，有些时候裂解液的冻融又可能影响某些弱的互相作用，所以不太建议冻融裂解液——即最好裂解液制备好后立即进展coIP。假如证实冻融无影响可考虑将蛋白样品保存-80度待用。
5. Tag的影响
His-tagged主要用于纯化蛋白。用His-tagged蛋白进展coIP存在潜在的隐患。因为很多蛋白会有富含histidine的domain，遇到效价非常好的抗体会使很多内源性的蛋白都被该抗体识别。造成coIP的假象。
TAP tag不能用于分析钙调信号通路。TAP tag实际上从本钱角度和His tag差不多，洗脱试剂价格低廉，因此可用于质谱分析，能获取最全面的互相作用的信息。然而由于其中包含钙调蛋白和蛋白A的互相作用domain，天然会结合钙信号相关蛋白，从而干扰或掩盖靶蛋白与钙信号蛋白之间的互相作用，有一定的应用局限。
Myc、HA、Flag-tagged：Myc仍然会有天然的干扰，应用略有局限；相较后两者是人工合成专门用于tagge