血清蛋白电泳实验报告血清γ球蛋白的分离纯化实验报告.doc

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血清蛋白电泳实验报告血清γ-球蛋白的分离纯化实验报告
血清γ-球蛋白的分离纯化 一、目的与要求 1、掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程。
2、熟悉盐析、离心、层析、电泳等生化基本技术在蛋白质分离纯
血清蛋白电泳实验报告血清γ-球蛋白的分离纯化实验报告
血清γ-球蛋白的分离纯化 一、目的与要求 1、掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程。
2、熟悉盐析、离心、层析、电泳等生化基本技术在蛋白质分离纯化中的综合应用。
3、学会设计和制定分离纯化蛋白质的实验方案，技术路线，质量监控和保证措施。
二、实验原理 血清蛋白有300多种，可粗略的分为清、球蛋白两大类，γ球蛋白只是球蛋白中的一个亚类。欲用常规方法获得，可先用半饱和硫酸铵从血清中盐析出球蛋白，接着用葡萄糖凝胶G-25脱去球蛋白中的盐分最后用DEAE纤维素阴离子交换柱便可直接从脱盐的球蛋白溶液中分离纯化出γ球蛋白,其反应机理如下：
C2H5 H 纤维素-O-(CH2)2-N(C2H5)2 纤维素-O-(CH2)2-N+……H2PO4 H++H2PO4 DEAE纤维素离子交换柱 COOH C2H5 α、β、γ球蛋白 NH2 COO H 经过盐析和脱盐的球蛋白液 纤维素-O-(CH2)2-N+…α和β G NH2 交换到柱上的α和β-球蛋白 H2PO4 COOH γ-球蛋白 NH3+ 被DEAE柱分离纯化的γ-球蛋白 被柱层析交换结合的α球蛋白和β球蛋白，可通过增加洗脱液的离子强度或降低洗脱的pH值（也可两者同时改变），使其分部洗脱下来而被纯化。纯化前后的γ球蛋白可用电泳方法进行比较鉴定。

三、仪器和材料 仪器：离心机，×40cm层析柱，层析架或滴定台，核酸-蛋白检测仪，部分收集器，紫外分光光度计，色谱柱，电泳槽，电泳仪。
材料：马血清，Sephadex G-25×200g，DEAE-32×200g。
四、 实验步骤
（一）分离纯化步骤
1、取3mL,4℃预冷血清，加入3mL 4℃预冷的饱和硫酸铵。边滴边摇。
2、静置大于10min后，3500rpm离心15min ，弃去上清液，将沉淀溶于少量的生理盐水。。
3、将剩余的样品上Sephadex G-25柱， mol/L 的NH4AC缓冲液洗脱，每管收集3 mL，用于绘制洗脱曲线，选择颜色最深（即浓度最高管）。

4、将剩余的蛋白质溶液上已平衡好的DEAE-32柱（装一半的柱子）， mol/L NH4AC缓冲液洗脱，用干净的试管收集，并用20%磺基水杨酸检测是否有蛋白流出，并绘制洗脱曲线，收集的蛋白质溶液即为γ球蛋白（留少量电泳用，[Pr]）。
5、柱子再生。，。
（二）电泳步骤
1、安装垂直板电泳槽，按表配制分