文档介绍：质粒 DNA 及λ DNA 的酶切、连接、转化及重组子的筛选、鉴定一、实验目的 1 、学****和掌握限制性内切酶的特性 2 、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 3 、掌握利用 CaCl2 制备感受态细胞的方法 4 、学****和掌握热击法转化 的原理和方法 5 、掌握α互补筛选法的原理 6 、学****用试剂盒提取重组质粒 DNA 的方法 7 、复****琼脂糖凝胶电泳的原理及方法二、实验原理: 外源 DNA 与载体分子的连接即为 DNA 重组技术,这样重新组合的 DNA 分子叫做重组子。重组的 DNA 分子式在 DNA 连接酶的作用下,有 Mg2+ 、 ATP 存在的连接缓冲系统中, 将分别经限制性内切酶酶切酶切酶切酶切的载体分子和外源 DNA 分子连接连接连接连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中导入感受态细胞中导入感受态细胞中导入感受态细胞中, 将转化后的细胞在选择性培养基选择性培养基选择性培养基选择性培养基中培养, 可以通过αααα互补筛选法互补筛选法互补筛选法互补筛选法筛选出重组子, 并可通过酶切酶切酶切酶切电泳电泳电泳电泳及 PCRPCRPCRPCR 检验检验检验检验的方法进行重组子的鉴定。 1. 重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱,选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点, 否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体 DNA 时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法,即只用一种限制性内切酶切割目的 DN A 片段, 酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端, 再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时, 除了形成正常的重组子外, 还可能出现目的 DNA 片段以相反方向插入载体分子中, 或目的 DNA 串联后再插入载体分子中, 甚至出现载体分子自连, 重新环化的现象。单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件, 最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成, 在双酶切体系中, 限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐,先低温后高温”的原则进行反应。(要达到高效率的连接,必须酶切完全,酶切的 DNA 数量要适当。另外,酶切反应的规模也取决于需要酶切的 DNA 的量,以及相应的所需酶的量。可以适当增加酶的用量, 但是最高不能超过反应总体积的 10% ,因为限制性核酸内切酶一般是保存在 50% 甘油的缓冲液中,如果酶切反应体系中甘油的含量超过 5% ,就会抑制酶的活性。) 连接反应总是紧跟酶切反应, 外源 DNA 片段与载体分子连接的方法即 DNA 分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和 DNA 连接酶催化完成的。 DNA 连接酶催化两双链 DNA 片段相邻的 5’- 磷酸和 3’-OH 间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的 DNA 连接酶是来自 T4 噬菌体的 T4 DNA 连接酶, 它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时,载体 DNA 和外源 DNA 的摩尔数之比控制在 1:( 1~3 )之间,可以有效地解决 DNA 多拷贝插入的现象。反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间,一般是 16℃,用常用的连接时间为 12-16h 。 2. 感受态细胞的制备及质粒转化构建好的重组