文档介绍：注射用银杏叶提取物及其制剂中总银杏酸含量的测定
摘要 目的:建立超高效液相色谱串联三重四极杆质谱测定注射用银杏叶提取物及其制剂中总银杏酸的方法。方法:采用HLB固相萃取净化制剂,Waters Cortecs T3色谱柱(50 m银杏叶提取物中最主要的毒性物质,具有潜在的致敏、致突变作用和强烈的细胞毒性作用[1-2]。银杏酸是6-烷基或6-烯基水杨酸的衍生物,主要包括银杏酸C13:0、C15:0、C15:1、C17:1、C17:2,化学结构见图1。其中C13:0、C15:1、C17:1占总银杏酸的94%以上[3]。《中华人民共和国药典》2015年版[4]规定银杏叶提取物中总银杏酸含量不得过百万分之十。美国药典和欧洲药典以3种银杏酸含量之和作为总银杏酸含量[5],规定总银杏酸含量不得过百万分之五。而注射剂作为高风险剂型,应当更加严格控制其含量。
目前,文献[6-10]多采用HPLC法测定银杏叶提取物中总银杏酸含量,但受限于该方法的灵敏度,检出限已接近百万分之十的限度,不能满足更加严格的限量控制要求。为提高灵敏度和专属性,亦有文献采用LC/MS法[11]、GC/MS法[12]、二维液相色谱法[13]等。
作者团队近年来已针对多种基质开发了UHPLC/MS/MS法测定其中总银杏酸含量(3种主要银杏酸C13:0、C15:1、C17:1总量)[14-15]。因注射用银杏叶提取物更加严格的限量控制(不得过百万分之二),且其制剂杏芎***化钠注射液中银杏叶提取物含量极低(约110 μg/mL)、基质复杂(磷酸川芎嗪、***化钠等辅料),目前缺乏相关研究。本文建立了UHPLC-MS/MS法解决灵敏度问题,采用的固相萃取前处理技术解决制剂纯化富集的问题。 1 仪器与试药
仪器
Agilent 1290超高效液相色谱仪;Agilent 6495三重四极杆质谱;Waters Cortecs T3色谱柱(50 mm× mm, μm);Waters Oasis HLB固相萃取柱(规格:1 g/20 mL)。
试剂
银杏酸C13:0对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111690-200501)、银杏酸C15:1对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111762-200601),银杏酸C17:1对照品(同田生化公司,%,批号:16040916);甲醇、乙***、醋酸、甲酸均为色谱纯。
分析样品
10批注射用银杏叶提取物和3批杏芎***化钠注射液均为生产企业弘和制药有限公司提供。
2 方法与结果
色谱质谱条件 采用Waters Cortecs T3色谱柱(50 mm× mm, μm),以甲醇-1%冰醋酸溶液(90∶10)为流动相,待测成分全部出峰后以甲醇-1%冰醋酸溶液(99∶1)充分清洗至少10倍柱体积;对照品溶液及提取物供试品溶液进样量1 μL,注射液进样量5 μL。
电喷雾离子化(ESI)负离子模式;干燥气(N2)流速15 L/min,温度225 ℃;雾化气(N2) MPa;鞘气(N2)流速11 L/min,温度300 ℃;毛细管电压3 000 V。采用多反应监测方式(MRM)检测,监测离子、碰撞能量等参数见表1。
对照品溶液的制备 分别取银杏酸C13:0对照品、银杏酸C15:1对照品、银杏酸C17:1对照品适量,精密称定,加甲醇制成各含50 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL、0 ng/mL的系列混合溶液,作為对照品溶液。
供试品溶液的制备 1)注射用银杏叶提取物: g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇10 mL,称定重量,超声(功率180 W,频率42 kHz)20 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,滤过,取续滤液,即得。2)杏芎***化钠注射液:精密量取样品1 000 mL,上Waters oasis HLB固相萃取柱(规格:1 g/20 cc,预先依次用10 mL甲醇和10 mL水活化)上,用80%甲醇10 mL清洗,弃去洗液,再用甲醇20 mL洗脱,收集洗脱液并定容至25 mL,滤过,取续滤液,即得。
专属性试验 取注射液空白样品(缺银杏叶提取物), 2)制备空白溶液,进样测定,结果空白无干扰。
线性关系考察 分别取银杏酸C13:0对照品、银杏酸C15:1对照品、银杏酸C17:1对照品适量,精密称定,加甲醇制成50 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL、0 ng/mL的系列混合溶液,作为