文档介绍：05核酸分离检测
3. 核酸的分离与纯化
高电荷磷酸骨架比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性。
根据理化性质差异，选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法。
①酚提取/ 沉淀法
经典方法是酚:***仿抽物)冻贮于-70℃,可保存数年。
三、核酸的检测
PCR：常规PCR、RT-PCR、荧光定量PCR
杂交：膜杂交（Southern Blot、Northen Blot）、组织样品原位杂交
（real time PCR）
1996，美国Applied biosystems公司推出：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。
克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。
目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。
灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确。
与常规PCR的区别
常规PCR：PCR结束后对终点产物进行定量分析。
实时定量PCR：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。
两个重要概念
荧光域值（ threshold）：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上 ，一般荧光域值的设置是基线荧光信号的标准偏差的 10 倍。
Ct值（Cycles threshold ） ：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.
Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比 。
荧光定量PCR化学原理
非特异性荧光标记：SYBR Green
特异性荧光标记：TaqMan
① SYBR Green I荧光染料的作用原理
SYBR Green I ：结合于双链 DNA小沟。 PCR 反应体系中，SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号。
优点：与所有双链 DNA 结合，不必因为模板不同而特别定制——通用性；价格相对较低；一个 PCR 产物可以与多分子的染料结合，灵敏度很高。
缺点：能与非特异性双链DNA（如引物二聚体）结合。需要熔解曲线分析。
SYBR Green 熔解曲线分析
② TaqMan探针法
TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，设计为与目标序列上游和下游引物间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。当探针保持完整时，3‘端猝灭基团抑制5’发射基团的荧光发射。在PCR的退火期。探针模板发生特异性杂交。延伸期引物在Taq酶作用下延伸，到达探针处，Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，切割探针，荧光发射基团远离猝灭基团，荧光信释放。随着扩增循环数的增加，荧光基团不断积累。即荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。
优点 ：特异性高、重复性好、阴性结果确定、引物设计相对简单——公司网站
缺点：只是用于一个靶基因，成本高。
③定量方法
绝对定量：确定样品中某一核酸序列的拷贝数。
相对定量：样品中某一核酸序列相对与对照样本中同一核酸序列的表达。
绝对定量
通过标准品定量
绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。
标准样品的种类：含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒、含有和待测样品相同扩增片段的cDNA、PCR的产物
相对定量——通过内标定量
内标（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因
靶基因表达的相对量以靶基因相对其内标的ΔCT表示：ΔCT=靶基因CT-GAPDH CT
不同样本靶基因表达的差异以ΔΔCT表示，由最高ΔCT与其他各ΔCT分别相减而得。
靶基因表达的相对倍数以2-ΔΔCT表示。
阶段 P311平均CT GAPDH平均 CT ∆CT ∆∆CT
± ± ± -
± ± ± -
± ± ± -
P5 ± ± ±