文档介绍：实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法
一、实验目的：
1. 学****并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。
2. 巩固显微镜油镜的使用技术。
3. 巩固无菌操作技术
二、实验原理：
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革兰氏染色法是1884实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法
一、实验目的：
1. 学****并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。
2. 巩固显微镜油镜的使用技术。
3. 巩固无菌操作技术
二、实验原理：
：
。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
二、实验原理：
主要因为两类细菌细胞壁结构和成分不同。
G+菌细胞壁：肽聚糖含量高（90％）、交联程度高、肽聚糖层厚、脂类含量少→用乙醇不易脱色；
G-菌细胞壁：肽聚糖含量低（10％）、交联程度低，肽聚糖层薄、外壁层脂类含量较高→用乙醇易脱色。
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二、实验原理：
芽孢是某些G+菌形成的圆形或椭圆形的休眠体，抗热性和折光性较强。
芽孢的大小、形态、位置可做分类依据。
二、实验原理：
中央芽孢
末端芽孢
偏端芽孢
游离芽孢
二、实验原理：
芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难；
但当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行染色时，染料可进入菌体和芽孢；
进入菌体的染料经水洗后可被脱色；
当用对比度大、浅色的复染色剂（番红）染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色（绿色），而菌体呈复染剂颜色（红色）。
三、实验器材
：
革兰氏染色：培养12h-16 h枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或者金黄色葡萄球菌（ Staphyloccocus aureus ）和培养24 h大肠杆菌（Escherichia coli）
芽孢染色：培养36 h 的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium ）或者枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
2. 染色液和试剂：
革兰氏染色染色液：结晶紫、卢戈氏碘液、95%酒精、番红复染液；
芽孢染色液：5%孔雀绿水溶液、%番红水溶液 ；
二甲苯、香柏油 。
3. 器材：
载玻片、接种环、试管夹、酒精灯、擦镜纸、显微镜。
三、实验器材
（1）涂片：按常规方法将待检细菌制成薄的涂片。
（2）干燥：与简单染色法相同。
（3）固定，与简单染色法相同。
四、实验步骤
（4）染色：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），用夹子夹住涂片一端，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5-8min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。
（5）水洗：待玻片冷却后 ，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。
四、实验步骤
（6）复染：用蕃红水溶液染色2min。
（7）水洗：
（8）干燥：
（9）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。。
结果：芽孢呈绿色，菌体为红色。
四、实验步骤
芽孢染色结果
（芽孢呈绿色，营养体呈红色）
四、实验步骤
（10）实验完毕后的处理：
①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，。-3次。-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。
②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。
四、实验步骤
五、实验报告
1、给出（ Staphyloccocus aureus和Escherichia coli的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。
2. 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？
megaterium菌体形态，芽孢的形态及着生位置。它们各呈什么颜色。
，很少看到芽孢囊和营养细胞，你认为这是什么原因？
六、注意事项
1、革兰氏染色注意事项
（1）革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。
（2）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
（3）选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
2、芽孢染色注意事项
（1）供芽胞染色用的菌种应控制菌龄。
（2）染色过程中勿使染色液干涸。