文档介绍：chapter3初级分离31沉淀分离
蛋白质溶液的稳定因素
⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell)可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。
⑵蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）
因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电为盐的摩尔浓度
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盐析沉淀
方法:
A、 “Ks”分级盐析法：在一定pH值及温度下，改变盐浓度（即I）达到沉淀的目的。
B、“β”分级盐析法：在一定I下，改变溶液的pH值及温度达到沉淀的目的。
C、应用：一般的初步分离用第一种方法，
进一步纯化时用第二种方法。
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盐析沉淀
Ks盐析法:由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。
β盐析法:由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。
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盐析沉淀
影响因素
A、无机盐种类
一系列盐沉淀蛋白质的能力进行了测定研究。
阴离子排序为：柠檬酸根3- >酒石酸根3- >F- > IO-3 > H2PO-4 > SO-4 > CH3COO- > Cl- > ClO-3 > Br- > NO-3 > ClO-4 > I- > CNS-;
对阳离子排序为： Al3+ > H+ > Ba2+ > Ca2+ > Cs+ > NH4+ > K+ > Na+ > Li+
如何设计实验？ 结论？
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盐析沉淀
结论：
a 不同种类的盐主要影响Ks；
b 离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好。
无机盐的挑选原则：
a 较高的盐析效能；
b 高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液；
c 溶解度受温度的影响小；
d 盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离；
e 不易引起蛋白质的变性；
f 价格低廉；
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想一想
什么盐溶液适合盐析呢？
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最常用(NH4)2SO4
优点：符合上述要求；
缺点：水解后溶液pH降低，在高 pH下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。
次常用Na2SO4。缺点：在400C以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。
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盐析沉淀
B、无机盐添加方式
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盐析沉淀
C、温度T
T影响Cohn方程中的值。T ， ；T ， 。
Why?
P39
离子强度较高时，升高温度有利于蛋白质失水
溶解度下降
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盐析沉淀
D、溶液pH
pH影响Cohn方程
中的值。
见图
此图有何用？
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pH=pI时，蛋白质溶解度最小（ 值最小）
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盐析沉淀
盐析沉淀操作，以硫酸铵为例
在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。
200C时，硫酸铵的饱和溶解度是761g/L（1L水加761g硫酸铵），， (534g/L)，定义为100%饱和度
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盐析沉淀
20℃，硫酸铵添加量计算（M摩尔浓度，S饱和度）
0℃，硫酸铵添加量计算
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25 ℃时
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如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。
具体操作方法见教材40页：
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等电点沉淀法 isoelectric point precipitation
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等电点沉淀法
在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀的操作称为等电点沉淀
pH=pI
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不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。
生产胰岛素时，，。
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等电点沉淀法
等电点沉淀法中的pH值作用于β值而隐含在Cohn公式中，
pI值通常在pH4~6范围内变化，一般用无机酸（如盐酸、磷酸和硫酸）作沉淀剂。
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蛋白质疏水性比较大 和结合水比较小 时这种类型的沉淀更有效。为了提高等电点法的沉淀能力